免疫荧光标记法

免疫荧光标记法

1、细胞膜上的免疫荧光检测法

间接标记法

1)    制备单细胞悬液；

2)    细胞计数，取出 1× 106 个细胞于试管中；

3)   用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90 ～ 95%；

4)   在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育 30 ～ 60 分钟；

5)    PBS 洗涤 1 ～ 2 次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清；

6)   加入二抗，孵育 20 ～ 30 分钟；

7)   PBS 洗一次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;

8)   加 300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测， 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定，可放置 1 周)。

直接标记法

① ~ ③同间接标记法

④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育 30 分钟；

⑤用 PBS 洗 2 次， 1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;

⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。

2、 细胞膜内的免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法

1)   取已制备好的单细胞悬液，用 1 ～ 3%的多聚甲醛固定 30 分钟（也可 4℃ 保存过夜 ）；

2)    用 PBS 洗两次，弃上清；

3)    细胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200μl，室温 10 分钟；

4)    用 PBS 洗涤两次；

5)   加入第一抗体， 室温 30 ～ 60 分钟，或 4℃过夜， 同时须设阴性对照或同 型对照管；

6)    用 PBS 洗涤两次；

7)   加入二抗（荧光标记的抗体）室温 20 分钟，避光；

8)    用 PBS 洗涤 1 ～ 2 次，弃上清；

9)    重悬细胞于 500μlPBS 中，上机检测。

直接荧光标记法

① ~ ⑤同间接荧光标记法；

加入荧光素标记好的抗体，避光 30 分钟（同时做同型对照管）；

用 PBS 洗涤1~2次，弃上清；

加 300μl PBS 上机检测。

细胞膜上及细胞内双标记法（ 直标法）

1)   取出已制备好的未固定的单细胞悬液 1× 10 6 个细胞于试管中； 2)    用 PBS 洗涤两次；

3)   加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原， 同时加上阴性对照管， 室温孵育 20 分钟；

4)   在试管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分钟；

5)   PBS 洗涤两次 1500rpm 3 分钟，弃上清;

6)   打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室温 10 分钟;

7)   用 PBS 洗涤两次，弃上清;

8)   加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素

的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温 20 分钟孵育;

9)    用 PBS 洗一遍弃上清；

10) 用 300μlPBS 重悬细胞，上机检测

五、流式细胞术中的几点注意事项：

1 、对照组的设置：

在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值

时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。

（ 1 ）、阴性对照的设置

² 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照

管，作为阴性对照。

² 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为  阴性对照管， 实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时 ，

同样也可同时设置“ 阴性细胞” 的阴性对照管作为阴性对照。

² 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加

上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。 

（2）、阳性对照的设置：

在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。

2、几点建议：

1)   在实验过程中， 在保证实验的科学性和准确性的基础上， 应尽量减少实验工 序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长， 如再加之操作的不熟练 ， 细胞更容易丢失和受损， 而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围 内， 建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法， 以保证实验的真实性和准 确性。

2)    建议送检细胞一定要足够量， 一般要求 1× 106 个细胞。不要过少。因为，如 细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数， 结果也不可信。 细 胞量也不宜过多， 因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足， 结果也由此受

影响。

3) 同一种细胞需同时做双标记时， 须做双标记的同型对照， 且两种抗体所标记 的荧光颜色务必不同。