植物碱性焦磷酸酶特点（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量试剂盒

植物碱性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

 植物碱性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量检测试剂是一种旨在使用无机焦磷酸，在碱性焦磷酸酶去磷酸化后，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后峰值的变化，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子、球茎（bulb）、块茎（tuber）、根（root）、种叶（coleoptile）和叶片裂解悬液样品或纯化以及粗提的酶蛋白的碱性焦磷酸酶活性及其抑制剂的检测。 产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

焦磷酸酶（Pyrophosphatase；PPase；；EC3.6.1.1），又称为无机焦磷酸酶（ inorganic pyrophosphatase），属于磷酸酶家族，包括磷酸单酯酶（phosphomonoesterase）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）等。通过释放磷酸根，参与DNA合成、RNA合成、辅酶合成、钙吸收、骨形成、氨基酸合成和脂肪酸代谢的激活等代谢活动。焦磷酸酶分为碱性和酸性，前者作用于合成代谢，而后者作用于分解反应。焦磷酸酶催化无机焦磷酸水解产生2个磷酸根离子的反应，为能量释放反应（exergonic reaction）。在植物中，尤其碳4或碳3植物的叶片中，活性最高。在固碳还原和光合作用起着重要作用成为碳4植物通路的指标。基于底物无机焦磷酸，在碱性条件下，受到碱性焦磷酸酶的去磷酸化作用，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后，在分光光度仪下（660nm波长）产生峰值的变化，由此测定碱性焦磷酸酶的活性。

产品内容

 清理液（Reagent A）         毫升

 裂解液（Reagent B）         毫升

 缓冲液（Reagent C）         毫升

 阴性液（Reagent D）         毫升

 反应液（Reagent E）         微升

 显色液（Reagent F）         毫升

 标准液（Reagent G）         微升

产品说明书             1份

保存方式

保存  裂解液（Reagent B）和  显色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；  显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触； 有效保证3月

用户自备

15毫升离心管：用于样品处理的容器

1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织样品

（微型）台式离心机：用于样品收集

培养箱：用于孵育反应物

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好新鲜的植物组织，并秤重以确定组织重量200毫克

1． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

2． （选择步骤）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次

3． 移入到一个液氮冻存管

4． 即刻放进液氮罐过夜

5． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

6． 放进一个15毫升锥形离心管

7． 加入预冷的xx微升  裂解液（Reagent B）

8． 涡旋震荡5秒，充分混匀

9． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

10． 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）

11． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管

12． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如植物裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为660nm，并置零  

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 按下表分别加入  阴性液（Reagent D）和  标准液（Reagent G）到每个离心管，混匀

5． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取200微升上述配制的标准液到新的比色皿

2． 在30℃温度下孵育20分钟

3． 加入xx微升  显色液（Reagent F），混匀

4． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

5． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

6． 重复实验步骤1至6四次

7． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

四、 样品背景测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量100微克植物裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃温度下孵育10分钟

4． 加入xx微升  阴性液（Reagent D），混匀

5． 加入xx微升  显色液（Reagent F），混匀

6． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）

五、 样品活性测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量100微克植物裂解萃取液蛋白）

3． 在30℃温度下孵育2分钟

4． 加入xx微升  反应液（Reagent E）

5． 在30℃温度下孵育10分钟

6． 加入xx微升  阴性液（Reagent D），混匀

7． 加入xx微升  显色液（Reagent F），混匀

8． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

9． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

10． 根据标准曲线获得样品总活性对应磷浓度（微摩尔/升）

六、 计算样品活性

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括5次（点）标准测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需1条

4． 样品背景读数大于1.0，建议稀释样品至0.5-1.0之间

5． 如果加样精准，样品背景读数可以跳过

6．  显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触

7． 样品切忌使用磷酸缓冲液处理

8． 比色测定后，比色皿须清洗

9． 建议使用比色皿测定

10． 如果使用96孔板测定，建议反应孵育时，置于平式摇荡仪摇荡孵育，速度为50RPMcedi

11． 如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代

12． 吸光读数增高，表明具有酶活性

13． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； （本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

14． 碱性焦磷酸酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 8.9的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的磷

15． 本公司提供系列磷酸酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

本产品经鉴定检测准确