ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7μm糖基分析专用柱的安装使用

II. 入门指南

  每根ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7μm糖基分析专用柱均附带一份分析证书和一张性能测试色谱图。分析证书与每批填料相对应，其中包括批号以及填料的理化特性分析结果。粒径和孔结构均在键合之前进行分析。我们测量了键合的碳和氮含量以确保一致的覆盖率，还通过沃特世糖基性能测试标准品(部件号186006349)的色谱分离效果对每批填料的选择性进行了评估，该糖基性能测试标准品为Man-5和Man-6(来自人源IgG)加标的2-AB标记N-糖标准品混合物。IgG糖基的复杂混合物中含有高甘露糖结构以及中性和酸性复杂结构。我们使用所选组分的保留时间及保留时间差异对每批填料进行质量控制测试。性能测试色谱图为每根色谱柱所特有，含有以下信息：批号、色谱柱序列号、反压、USP塔板数、折合塔板高度(RPH)、USP拖尾因子、保留因子(k')、峰宽和色谱条件。这些数据包含于每根色谱柱随附的eCord™中，用户应妥善保存，以备将来参考。

a. eCord安装

  eCord按钮应当安装在柱温箱模块的侧面。eCord按钮经过磁化处理，无需专门定位。

b. 色谱柱接头

  ACQUITY UPLC、ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系统所采用的管路和镀金压力螺母经过专门设计，可达到严格容差水平并能最大限度减少系统扩散。

  对于ACQUITY UPLC系统，色谱柱应连接至具有色谱柱稳定器的进样器，色谱柱稳定器有4种类型：

●205000291 50或100 mm色谱柱

●205000365 150 mm色谱柱

●205000489 HTCH 50或100 mm

●205000494 HTCH 150 mm

  前两种部件适用于原柱温箱，它们具有不同的管路布置，使150 mm色谱柱也可与VanGuard™预柱或在线过滤器配合使用，同时保持稳定的溶剂温度。后两种部件适用于新

型高温柱温箱(HTCH)。ACQUITY UPLC系统可提供最佳的色谱柱入口管路。在管路的进样阀端明确标识了蓝色热缩管标记。将管路的另一端插入ACQUITY UPLC色谱柱，并用两个5/16 in扳手拧紧压力接头(或用手拧紧滚花螺母)。

  如果该色谱柱将用于ACQUITY UPLC H-Class或ACQUITY UPLC H-Class Bio系统，您只需将色谱柱通过镀金手紧接头连接至系统上的主动预加热器即可。ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系统上的色谱柱稳定器仅有一种配置。

  有关接头和连接管路的更多信息，请参阅ACQUITY UPLC、ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系统操作员指南的相关部分。

c. 色谱柱安装

  注：下述步骤给出的流速适用于填料粒径1.7μm、内径2.1 mm的典型色谱柱。

1. 清除溶剂输送系统中任何含有缓冲液或与水混溶的流动相，并将色谱柱的入口端连接至进样器出口。色谱柱识别标记上的箭头指示了正确的溶剂流向。

2. 通过将泵流速设置为0.1 mL/min，并且在3 min内增加至0.25 mL/min，用100%有机流动相(乙腈)冲洗色谱柱。在10 min内将水相增加至90%。请注意反压。将水相比例降至起始条件(测试色谱图中采用22%水相)。

3. 当流动相可从色谱柱出口自由流出时，停止液流并将色谱柱出口连接至检测器。这样可以防止空气进入检测系统，更快速地达到基线平衡。

4. 在3 min内将流速从0.25 mL/min逐渐增加至0.5 mL/min。

5. 一旦反压和基线达到稳定状态，即可继续进行下一部分操作。

d. 色谱柱平衡

  糖基分析专用柱出厂时保存于100%乙腈中。在将色谱柱更换至其它流动相系统之前，务必要确保流动相的相容性。至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱(参见表1中的色谱柱体积)。

  为了避免流动相缓冲液在色谱柱或系统中发生沉淀，使用5倍柱体积的水/有机溶剂混合物冲洗色谱柱，其中乙腈含量与所需缓冲液流动相中的乙腈含量相同或更高。例如，使用50%乙腈水溶液冲洗色谱柱和UPLC系统，然后再引入50%乙腈/50%缓冲液流动相。

  溶剂的级别和质量对于糖基分析非常重要。我们强烈推荐仅使用LC-MS级试剂配制糖基分析流动相洗脱液。我们还强烈推荐使用沃特世甲酸铵溶液(部件号186007081)配制洗脱液A。沃特世甲酸铵溶液是由LC-MS级试剂制成的浓缩液，能够减少带有不良标记的糖基加合物的生成。

  色谱柱平衡可以先通过稳定的压力和稳定的检测器基线来进行判定。但是，对于特定的应用，则需要测试所需的平衡持续时间。充分平衡的标准包括主峰和次要峰保留时间的重现性、关键分析物对的分离度和一致的基线特性。

  注：低浓度流动相添加剂，尤其是那些具有最小缓冲容量的添加剂其梯度分析之间可能需要更长的平衡和再平衡时间。

e. 初始柱效测定

1. 将色谱柱用于所需应用前，需执行柱效测试。沃特世推荐在收到色谱柱后使用“性能测试色谱图”中所述的溶质混合物和条件对色谱柱进行测试。这些条件记录在安装于色谱柱上的eCord中。

2. 测量被测化合物的保留情况和理论塔板数(N)。

3. 以预定的时间间隔进行重复测试，以跟踪色谱柱性能随时间的变化情况。使用两个不同的UPLC系统进行测试，所得柱效结果可能会有微小差异，这可能是由于连接质量、运行环境、系统电子设备、试剂质量、色谱柱条件和操作员技术等因素所致。

f: 新色谱柱活化

  良好的规范是在分析实际待测样品之前，确保全新(之前未使用过的)BEH Amide, 130Å糖基分析专用柱经过良好的活化并可提供最佳性能。该过程可通过连续进样代表性样品直至获得稳定的色谱图来完成。

  还应注意，即使BEH Amide糖基分析专用柱将与甲酸铵流动相配合使用，先采用梯度和含有0.1% TFA的流动相对其活化仍非常有用。一些离子态污染物可能会强烈吸附到HILIC固定相上，TFA能够中和这类污染物以及与其形成离子对，从而有效清洗色谱柱固定相。

g. 对新色谱柱进行基准检查的实用性功能测试：

糖基性能测试标准品

  我们建议使用沃特世糖基性能测试标准品(部件号186006349，用于2-AB；或186007983，用于RapiFluor-MS)对新色谱柱进行基准检查并监测其使用过程中的性能变化。

  注：沃特世在ACQUITY UPLC BEH Amide 130Å, 1.7 μm糖基分析专用柱生产过程中，采用部件号186006349的标准品对专为此应用设计的每批柱填料进行质量控制测试(参见图1的示例)。

  在本示例中，我们将100 μL的100 mM甲酸铵缓冲液(pH 4.5)和100 μL乙腈直接加入样品瓶中，得到总体积200 μL的标准溶液。

  通过倒置轻轻混合样品。

储存和稳定性

  收到标准品后，如需在溶解之前进行长期储存，请直接将其以原包装的形式储存在-20℃下。溶解后之后，可将标准品等份分装并储存在-80℃下(最多保存3个月)或储存在4-10℃下(为避免发生降解，保存时间不得超过一周)。应最大程度减少冻融次数。

通用色谱方法

  以下列出的条件适用于ACQUITY UPLC系统。如果使用ACQUITY UPLC H-Class或ACQUITY UPLC H-Class Bio系统，请使用50/50乙腈/水作为清除溶剂和清洗溶剂。所有其它条件可保持不变。

  请注意，ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系统不采用强洗针液和弱洗针液。相反，它们采用清除溶剂和清洗溶剂，两种溶剂均应为50/50乙腈/水。

  还应当注意该应用的进样溶剂和进样体积。较大的糖基在含50%以上乙腈的溶液中溶解度较差。在这类条件下较大的糖基将逐渐沉淀而导致损失。然而，还应注意到，在HILIC色谱分析中，含水样品采用较大的进样体积时会使峰形变形。这类应用中的最佳进样体积为<3 μL。

进样体积：1.5 μL

进样模式：部分定量环进样(20 μL定量环)

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7μm

糖基分析专用柱(部件号186004742)

洗脱液A：100 mM甲酸铵，pH 4.5

洗脱液B：乙腈

弱洗针液： 乙腈/HPLC级水，(90/10 v/v)

强洗针液： 乙腈/HPLC级水，(10/90 v/v)

密封清洗液： 乙腈/水(50/50，v/v)

温度： 60 °C

检测： 荧光：λex = 330 nm，

λem = 420 nm

  注：在本《维护和使用手册》中，不需要使用肽针和额外的混合器来执行分离。然而，如果这些组件在其它应用分析过程中已安装于系统上，则无需将其移除。如果安装了这些组件，N-糖的分离质量应不受影响。

  该色谱图是沃特世实验室按上述方法，使用ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7 _m, 2.1 x 150 mm糖基分析专用柱获得的典型结果。保留时间在柱长为100 mm的色谱柱上将减少33%，在柱长为50 mm的色谱柱上将减少67%，并且组分峰的分离度也将以相应的比例减小，如图2所示。由于这些色谱柱适用于具有低死体积、耐高压和高灵敏度的ACQUITY UPLC系统，因此色谱保留时间将非常接近。差异将由系统体积(例如混合器体积)和扩散、柱温箱以及检

测器流通池引起。该测试对于监测色谱柱寿命和解决可能出现的分离难题具有极其重要的意义。

III. 色谱柱使用

  为了确保ACQUITY UPLC BEH糖基分析专用柱始终保持优良性能，请遵循以下原则：

a. 样品制备

1. 样品中的杂质通常会污染色谱柱。样品在进样到系统前，不应含有颗粒物质。

2. 在大多数应用中，最好使用与初始梯度组成相同的溶剂来配制样品。但典型的HILIC初始条件中乙腈浓度较高，而带标记的糖基通常不能溶于高浓度乙腈中。由于是进行小体积进样，因此样品稀释剂中可含有高于初始组成的水相(例如50%)。

  注：分析Waters RapiFluor-MS标记的糖基时，我们推荐使用乙腈和二甲基甲酰胺的混合物(请参见《GlycoWorks™ RapiFluor-MS N糖试剂盒维护和使用手册》部件号715004793ZH)。

3. 如果样品不溶于流动相或本手册中指定的溶剂组合，请确保样品、溶剂和流动相可以混溶，以避免样品和/或缓冲液产生沉淀。带标记的糖基在制备时可能包括一步或两步固相萃取步骤。因此，蛋白质沉淀通常已经被除去。否则，在>10000 rpm下离心2 min以上，除去蛋白质颗粒。

b. pH操作限值

  ACQUITY UPLC BEH糖基分析专用柱的推荐pH操作范围为3–8。表2中列出了常用的缓冲液和添加剂。此外，柱寿命将根据运行温度以及使用的缓冲液类型和浓度而有所不同。

表2. 在pH 3–8范围内使用ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7 μm糖基分析专用柱的推荐缓冲液

c. 溶剂

  为了保持最佳的色谱柱性能，请使用优质的色谱级溶剂。如果过滤，我们推荐使用Acrodisc®过滤器。含有悬浮颗粒物的溶剂会损坏UPLC系统的流路组件，并且常常会堵塞色

谱柱的入口分配滤头。这会导致操作压力增大，性能变差。

d. 压力

  ACQUITY UPLC BEH糖基分析专用柱在90-100%的水性流动相中操作时，反压将显著上升。如图1的梯度表所示，用100% A清洗2.1 x 150 mm糖基分析专用柱时，需要将流速降至0.25 mL/min。虽然ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7μm糖基分析专用柱能够承受高达15000 psi(1034 bar或103 Mpa)的压力，但为了尽可能延长色谱柱和系统的使用寿命，应避免压力超过13000 psi。

  注：在极端压力、pH和/或温度条件下运行会导致色谱柱使用寿命缩短。

e. 温度

  为了增强选择性、降低溶剂粘度和提高传质速率，ACQUITY UPLC BEH Amide, 130Å, 1.7μm糖基分析专用柱的推荐操作温度范围为20-90 °C。但是，较高的温度会对色谱柱寿命产生不

良影响，色谱柱寿命还会根据pH和缓冲液条件而有所不同。