猪伪狂犬病毒实时荧光PCR试剂盒的操作方法

来源：上海晅科生物科技有限公司 2023年09月19日 10:07

病毒DNA的提取：

1.取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃动，不要吸到上层保护液)，用力颠倒10次混匀，12,000rpm离心10min。

2.取500µL上清置于灭菌离心管中，加入500µL异丙醇，混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，13,000rpm离心15min。

3.弃上清，沿管壁缓缓加入1mL洗涤液，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。

4.用30µL无菌水溶解沉淀，作为模板备用。

样品制备：

1.样品采集：病死或扑杀的猪，取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理盐水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。)

2.样品处理：

2.1组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.2全血样品的处理：待血凝后取血清放于离心管中，8000rpm离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.3阳性对照的处理：混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

2.4阴性对照的处理：混匀后取100µL于1.5mL灭菌离心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。

PCR：

1.反应体系：分别取16µLPCR反应液A(用前混匀)、2µLPCR反应液B(用前混匀)和2µL模板DNA，混匀。

2.反应程序：在PCR仪上运行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

电泳：

1.制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。

2.电泳：待胶凝固后，取5µLPCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳。

3.染色：取50倍稀释的TAE电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。

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