细胞低温冻存是培养室常用技术。那么你知道细胞冻存的原理和实验步骤吗？让我们一起来看看吧！

原理：

将细胞放在-196℃液氮中，可以使细胞暂时脱离生长状态，减少细胞代谢，理论上储存时间几乎是无限的。最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。上述要求可通过下列方法获得：

1.缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢，以避免冰晶形成；

2.用亲水的低温保护剂排除水分；

3.在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对冰中蛋白质变性的影响；

4.快速复苏，减少细胞内晶体形成，以及细胞内残余的冰溶解时可溶性成分的产生。

实验步骤：

1.选择无支原体污染且对数生长期的细胞，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液；

2.按常规方法将培养的细胞进行胰酶消化，然后 1000rpm 离心 5 分钟，去上清并收集细胞。然后加入已经配置好的冻存液，常用的冻存液是DMSO +wan全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液)，吸管轻轻吹打，重悬细胞。计数，调整至5×106/ml左右；

3.将细胞悬液分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液，旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记；

4.冻存：在液氮容器中，对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的，通常的操作是把细胞先在-20℃放1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜，再转入液氮罐，注意下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。推荐使用程序降温盒，操作方便，冻存效果更好。

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