α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性检测试剂盒（可见分光光度法）

产品货号：BA1933

产品规格：50T/24S

产品简介：

α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键 生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。

α-GC分解对-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速 率来计算α-GC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1瓶加10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂-20℃保存4周，避免反复冻融。

2. 标准品：5μmol/mL的对硝基苯酚溶液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每1000万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

2. 组织的处理：称取约0.2g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。 液体样本：直接检测。若溶液有浑浊需离心后取上清进行测定。  

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2. 标准溶液的稀释：将 5μmol/mL的标准液用蒸馏水稀释成100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。

3. 标准液稀释可参考下表。

实验中每个标准管需500µL标准溶液。

4. 加样表：

三、α-GC活力计算

1. 标准曲线的建立：

根据标准管的浓度（x，nmol/mL）和吸光度（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA测定）代入公式计算样本产物浓度x（nmol/mL）。

2. α-GC活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GC活力（U/mg prot）=（x×V反总）÷（V样×Cpr）÷T=20x÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GC活力（U/g 质量）=（x×V反总）÷（W×V样÷V样总）÷T=20x÷W。

（3）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α- GC活力（U/10⁴ cell）=（x×V反总）÷（1000×V样÷V样总）÷T=0.02x

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定；V反总：反应体系总体积，1mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万； T：反应时间，0.5h。

注意事项：提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。