中华人民共和国国家标准

GB/T 19539-2004

饲料中赭曲霉毒素A的测定

Determination of ochratoxin A in feeds

前言

  本标准中的薄层色谱方法和酶联免疫吸附测定方法主要依据GB/T 5009.96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定》中薄层色谱方法和卫生部食品卫生监督检验所建立的酶联免疫吸附法。本标准规定以薄层色谱法为仲裁方法，酶联免疫吸附测定法为快速筛选法。

  本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。

  本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。

  本标准由江苏省微生物研究所负责起草。

  本标准主要起草人：宓晓黎、袁建兴、李利东、丁贵平、成恒嵩。

1范围

  本标准规定了赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，以下简称OA）的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测定方法。

  本标准适用于配合饲料、饲用谷物原料中OA的测定。

  薄层色谱测定方法的最（zui）低检测量为2ng，酶联免疫吸附测定方法的最（zui）低检测量为0.05ng。

2规范性引用文件

  下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

  GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

  GB/T 14699.1饲料采样方法

3薄层色谱法（仲裁法）

3.1 原理

  试样中的OA经提取、液-液分配萃取、浓缩，然后进行薄层分离，限（xian）量定量，或用薄层扫描仪测定荧光斑点的荧光强度，外标法定量。

3.2试剂与材料

  所用试剂除另有规定，均使用分析纯试剂。水符合GB/T6682中一级水的规定。

3.2.1石油醚。

3.2.2 甲醇溶液（55+45）。

3.2.3三氯（lv）甲烷。

3.2.4苯-冰乙酸（99+1）。

3.2.5 40g/L氯化钠溶液。

3.2.6 无水硫酸钠：650℃灼烧4 h，冷却后贮于干燥器中备用。

3.2.7展开剂（用时选择一种）：

a）甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6+3+1.2+0.06）；

b）甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6+3+1.4）；

c） 苯-冰乙酸（9+1）。

3.2.8 显色剂：碳酸氢钠乙醇溶液（在100 mL水中溶解6.0 g碳酸氢钠，加20 mL乙醇）。

3.2.9薄层板：称取4g硅胶G，加约10mL 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成10 cm×20 cm、厚度0.3 mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板，除去杂质，吹干，在105℃~110℃活化1 h，置于干燥器内保存备用。

3.2. 10 OA标准储备溶液：

  警告：

  1凡接触OA的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl）溶液，半天后清洗备用。

  2为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。

  称取适量的OA标准品，用苯-冰乙酸（3.2.4）配制成约10μg/mL OA贮备液。贮备液置于4℃冰箱中避光保存。

  标定贮备液的浓度，用1 cm石英比色杯，以苯-冰乙酸（3.2.4）为参比，在0A的最大吸收峰波长333 nm处，测定吸光度值A。储备液中OA的含量（X1）以微克每毫升（μg/mL）表示，按式（1）计算。

式中：

A——测定的吸光度值；

M——OA的摩尔质量（M=403 g/mol）；

ε——OA在苯冰乙酸中的分子吸收系数（ε=555 m²/mol）；

δ——比色杯的光径长度，单位为厘米（cm）。

3.2.11 OA标准工作溶液：根据计算的OA标准储备液的浓度，精密吸取标准储备液（3.2.10）适量，用苯稀释成浓度为1.0 μg/mL的标准工作溶液。

3.3 仪器与设备

3.3.1小型粉碎机。

3.3.2电动振荡器。

3.3.3 薄层板涂布器。

3.3.4玻璃器皿：分液漏斗、蒸发皿、浓缩瓶。所有玻璃器皿均需用稀盐酸浸泡，依次用自来水、蒸馏水冲洗。

3.3.5 快速定性滤纸。

3.3.6 展开槽：250 mm×150 mm×50 mm（立式，具磨口）。

3.3.7紫外光灯：波长365 nm。

3.3.8点样器：1 μL~99 μL.

3.3.9薄层扫描仪：配有汞灯光源。

3.4试样制备

  按GB/T 14699.1饲料采样方法取得试样，四分法浓缩臧取约200 g，经粉碎，混匀，装入磨口瓶中备用。

3.5 分析步骤

3.5.1试样处理

  称取约20 g试样（3.4）（精确至0.01 g），置于200 mL具塞锥形瓶中，加30 mL石油醚和100 mL甲醇溶液（3.2.2），瓶塞盖紧。振荡30 min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待分层后，放出甲醇水层20 mL，置于100 mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为5~6。加入25 mL三氯（lv）甲烷，振摇2 min，静置分层后，放出三氯（lv）甲烷层于另一个分液漏斗中，再用10 mL三氯（lv）甲烷重复振摇提取甲醇水层（在用三氯（lv）甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），将三氯（lv）甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50mL~100mL氯化钠溶液（3.2.5），振摇，放置分层后，将三氯（lv）甲烷层放出，经装有约20 g无水硫酸钠的玻璃漏斗流入蒸发皿中，将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。用约8 mL三氯（lv）甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入浓缩瓶中，置60℃水浴减压浓缩至干，加℃2 mL苯冰乙酸（3.2.4）溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。

3.5.2 点样

  在距薄层板下端1.5cm~2cm的基线上，以1cm的间距，用点样器依次点标准工作溶液（3.2.11）2μL、4μL、7μL、10μL（相当于2 ng、4 ng、7 ng、10 ng）和试样液（3.5.1）20μL。

3.5.3 展开

  将薄层板放入有展开剂的展开槽中，展至离原点13 cm~15 cm，取出，吹干。

3.5.4 观察与确证

  将展开后的薄层板置于波长365nm紫外光灯下，观察与OA标准点（4ng）比移值相同处的试样的蓝绿色荧光点。若相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含量在本测定方法的最（zui）低检测量100μg/kg以下。如果相同位置上出现荧光点，用显色剂对准各荧光点进行喷雾后吹干，观察荧光点由蓝绿色变为蓝紫色且荧光强度明显加强可确证试样中含有OA。于荧光点下方用铅笔标记，待扫描定量测定。

3.5.5 定量测定

3，5.5. 1薄层扫描工作条件

  光源：高压汞灯；

  激发波长：365nm；

  发射波长：450 nm；

  检测方式：反射；

  狭缝：可根据斑点大小进行调节；

  扫描方式：距齿扫描。

3.5.5.2 标准曲线绘制

  以OA标准工作溶液质量（ng）为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.6 结果计算和表述

  根据试样液荧光斑点峰面积扫描积分值从标准曲线上查出对应的OA质量（ng），试样中OA的含量（X）以微克每千克（μg/kg）表示，按式（2）计算。

式中：

V1——试样液（3.5. 1）最后定容体积，单位为微升（μL）；

V2——试样液点样体积，单位为微升（μL）；

m1——从标准曲线上查得试样液点上对应的OA的质量，单位为纳克（ng）；

m0——最后提取液相当试样的质量，单位为克（g）。

计算结果表示到小数点后一位有效数字。

3.71复性

  在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于10%。

4酶联免疫吸附测定法（怏速筛选法）

4.1原理

  方法的检测依据是抗原抗体反应。将OA抗体的羊抗体吸附在固相载体表面，加入OA抗体、酶标OA结合物、OA标准或试样液，在OA抗体与固相载体表面羊抗体结合的同时，游离的OA、酶标OA结合物与结合在固体表面OA抗体竞争，未结合的酶标OA结合物洗涤除去。加入酶底物，在结合酶的催化作用下，无色底物降解产生有蓝色物质。加入终止剂后颜色转变为黄色。通过酶标检测仪，在450nm波长处测吸收值。吸光强度与试样中OA的浓度成反比。

  酶联免疫吸附测定法具有操作简单，快速灵敏，结果可靠的特点。目前有专门测定OA的酶联免疫检测试剂盒的商品。在分析时适当参考操作说明书。

4.2试剂与材料

4.2.1 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔或48孔。

4.2.2 70% 甲醇溶液。

4.2.3 OA标准溶液：精密吸取标定后的标准储备液（3.2.10）适量，用甲醇溶液（4.2.2）配制成OA标准溶液1~5，浓度分别为0 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、4 μg/L、8 μg/L。

4.2.4 酶标抗原溶液：OA与辣根过氧化酶结合物。

4.2.5抗体溶液：OA抗体。

4.2.6柠檬酸缓冲溶液[c（Na3C6H5O7）=0.1 mol/L，pH=4.0]：称取10.147 1 g柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O），13. 764 2 g柠檬酸（C6H8O7•H2O）加水溶解至1 L。

4.2.7底物溶液甲：四甲基联苯胺，用柠檬酸缓冲溶液（4.2.6）配成浓度为0.4g/L。

4.2.8底物溶液乙：取 1.5 mL 30%过氧化氢，用柠檬酸缓冲溶液（4.2.6）稀释至1 L。

4.2.9底物溶液：底物溶液甲与底物溶液乙1 ： 1的混合液。

4.2.10终止液：硫酸溶液（1+17）。

4.3仪器与设备

4.3.1酶标测定仪：带 450 nm波长。

4.3.2小型粉碎机。

4.3.3 50μL、100μL、1000μL微量移液器。

4.3.4电动振荡器。

4.3.5 玻璃器皿：50 ml锥形瓶、漏斗、量筒。

4.3.6快速滤纸。

4.4试样制备

  同3.4。

4.5分析步骤

4.5.1试样处理

  称取约5 g试样（4.4）（精确至0.01 g），置于50 mL具塞锥形瓶中，加入12.5 mL甲醇溶液（4.2.2），密塞。振荡器（4.3.4）提取5 min。提取液通过快速滤纸过滤，敢1 mL滤液，加9 mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。

4.5.2分析前注意事项

  分析前将所有试剂平衡至室温；分析后立即将所有试剂放回2℃~8℃冰箱；在所有培育中，避光，盖上微孔板盖。

4.5.3定位

  根据需要设定限（xian）量法（如表1）和定量法（如表2）。取足够数量的微孔置微孔架上，标准品和试样做两个平等实验，记录标准品孔和试样孔的位置。限（xian）量法时控制标准品孔号中的浓度为限（xian）量值/稀释因子，并通过调节稀释因子使之浓度在0 μg/L~8 μg/L范围内。

4.5.4加试剂

  在每孔中依次加入试剂：加入50 μL标准溶液（4.2.3）或试样提取液（4.5.1）至相应微孔中；加入50 μL酶标结合物（4.2.4）到每个微孔中；再加入50 μL OA抗体（4. 2. 5）到每个微孔中。

4.5.5反应

  将酶标板轻轻摇晃，使孔中的试剂摇匀，置温度18℃~30℃培育反应10 min。

4.5.6洗涤

  将微孔中液体倾倒到水池内，倒置微孔支架，在千净纸巾上轻拍，除去所有残留的液体，用移液器加蒸馏水250 μL到每个微孔中，洗板，放置2 min，再排空液体，重复洗涤3次。

4.5.7显色

  加100 μL底物溶液（4.2.9）到每孔中，充分摇匀，置18℃~30℃恒温箱中，反应5 min。

4.5.8 终止

  加100 μL终止液（4.2. 10）到每孔中，摇匀。

4.5.9测定

  在450 nm处，以空气为空白调零，测定吸收值。在60 min内读数。

4.6结果计算和表述

4.6.1 限（xian）量法

  若试样孔的吸收值小于标准品孔的吸收值，即A_试样孔<A_标准孔，超过限（xian）量值，为阳性。若试样孔的吸收值大于或等于标准品孔的吸收值，即A_试样孔≥A_标准孔，则小于或等于所设限（xian）量值，为阴性。

  限（xian）量值为标准值（μg/L）乘以稀释因子。按4.5.1操作，稀释因子为25，若控制标准值为4 μg/L时，试样中OA的限（xian）量在100 μg/kg。

4.6.2 定量法

  百分吸收值：所得的标准或试样的吸收值除以第一个标准（0标准）的吸收值再乘以100，作为百分吸收值A% ，按式（3）计算。

式中：

A——标准品或试样的吸收值；

A0——空白的吸收值。

  标准曲线的绘制：所计算的百分吸收值对应OA浓度（μg/L）的半对数坐标作标准曲线图，曲线在1 ng/kg~8 ng/kg范围内应当成线性。根据试样的百分吸收值，通过标准曲线，查得相对应浓度。试样中OA的含量（X）以微克每千克（μg/kg）表示，可按式（4）计算。

式中：

c——从标准曲线上查得相对应试样提取液（4.5.1）中OA浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V——试样提取液（4.5.1）体积，单位为毫升（mL）；

n——试样稀释倍数；

m——试样质量，单位为克（g）。

计算结果表示到小数点后一位有效数字。

4.7重复性

  在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于15%。