贴壁细胞如何进行传代培养？

随着CAR-T治疗的火热，细胞和基因治疗也进入了白re化的状态，细胞培养就称为通向CAR-T治疗的第一步。贴壁细胞如何进行传代培养？让我们一起来看看吧！

一、所需材料

 ★  装有贴壁细胞的培养容器

 ★  经过组织培养处理的培养瓶、培养板或培养

 ★  wan全生长培养基，预热至 37℃

 ★  一次性无菌15ml试管

 ★  37 ℃培养箱，充有二氧化碳浓度为 5%的湿化空气

 ★  平衡盐溶液，例如: 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)，不含钙、镁和酚红消化酶，例如：胰蛋百酶，不含酚红

二、贴壁细胞传代流程

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

1. 取对数生长期的贴壁细胞，弃掉旧培养基；

2. 用磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗细胞1-2遍。 (每10cm²培养表面积需要2ml 溶液)。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次；注:冲洗步骤可去除可能抑制消化酶作用的少量血清钙和镁。

3. 从培养容器中吸出冲洗液并丢弃；

4. 向培养瓶中加入预热的消化酶(例如:胰蛋白酶);试剂量应足以覆盖细胞层(每10cm²大约0.5ml)。轻轻摇晃容器，使试剂wan全覆盖细胞层；

5. 将培养容器在室温下孵育约2分钟；

请注意，实际孵育时间根据所用细胞系不同可能有所差异。

6. 在显微镜下观察细胞解离情况。如果解离程度未达90%，可将孵育时间延长几分钟，每30秒钟检查一次解离情况。也可轻轻拍打培养容器以加快细胞解离。

7. 细胞解离程度大于等于90%时，倾斜培养容器，使细胞上液体尽快流尽。加入所用消化酶两倍体积的预热wan全生长培养基。轻柔吹打细胞层表面数次，使细胞分散成为单细胞悬液。

8. 将细胞转移到15ml离心管中，200g 离心5至10分钟。

请注意：离心速度和时间依细胞种类不同而有所差异。

9. 用最少体积的预热wan全生长培养基重新悬浮细胞沉淀。

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