知识讲解：细胞培养的步骤和注意事项

　　1:细胞复苏

　　低温保存的细胞从液氮中取出后，在37℃的水浴中不断摇晃，以促进其融化。将解冻后的细胞移入离心管，加入37℃(胎牛血清约10%)预热的DMEM培养基中，轻轻吹扫离心，500克离心2分钟，丢弃上清液。

　　加入DMEM清洗，并丢弃上清液。加入DMEM全培养基，轻轻吹匀，制成细胞悬液，接种于皿/瓶中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

　　2:细胞通道

　　当细胞密度达到80%～90%(早产不足，细胞条件不好，1:2～1:10或以上比例传代，一般1:3～1:5细胞发生，即从细胞接种到分离再培养的一段时间内，非细胞有丝分裂的次数)，取出完整培养基，洗涤两次1x PBS。

　　加入胰蛋白酶(注：消化液覆盖细胞的最佳量，最佳消化温度为37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞。如果细胞质收缩，细胞不再连接成碎片，说明此时细胞的消化是合适的)，并将其放入细胞培养箱中约2-3分钟。

　　加入适量DMEM全培养基停止胰蛋白酶消化，移入离心管离心2分钟，弃去上清液，然后加入DMEM全培养基洗涤，弃去上清液。

　　加入DMEM全培养基，轻轻吹匀，取10μL计数，按要求的细胞体积在含5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

　　3:细胞冷冻保存

　　当细胞密度达到80%～90%时，去除全培养基，用1x PBS洗涤两次。加入胰蛋白酶消化，放入细胞培养箱约2-3分钟。加入DMEM全培养基停止胰蛋白酶消化，移入离心管，离心500g，离心2min，弃去上清液，然后加入DMEM全培养基洗涤，弃去上清液。加入LML冻存液(90%胎牛血清，10%二甲基亚砜)。一般来说，血清含量可以在10%到90%之间调节。一方面在冻存液中加入血清可以为细胞提供营养，另一方面可以提供蔗糖、白蛋白等不渗透的保护物质，在冻存过程中更好地保护细胞。放入低温保存管(管内加入异丙醇，以保证降温速度)，立即放入4℃冰箱内冷冻30分钟，然后放入-20℃冰箱30分钟，再放入-80℃冰箱过夜。

　　第二天放入液氮中，至少可以保存两年。如果没有，可以保存三个月。

　　细胞冷冻复苏的原理是：缓慢冷冻和快速解冻，这样更有利于保持细胞的活力。不加任何保护剂的细胞低温保存会导致细胞内产生冰晶，引起细胞内的机械损伤、渗透压、pH值和电解质的变化，进而导致细胞死亡。

　　4:注意事项

　　(1) 预热培养液：将配制好的含培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴中预热;

　　(2) 用75%酒精擦拭超净工作台和紫外线照射的手;

　　(3) 正确放置使用过的设备：保证足够的操作空间，既方便操作又减少污染;

　　(4) 酒精灯：注意火焰不要太小;

　　(5) 严格无菌操作;

　　(6) 贴壁细胞的消化是中等的：消化时间受多种因素的影响，如消化液的种类、制备时间和加入培养瓶中的量。在消化过程中，应注意培养细胞形态的变化。一旦细胞质收缩，连接变松，或有碎片漂浮的迹象，消化应立即终止;

　　(7) 传代细胞的所有操作应尽可能靠近酒精灯火焰。最好一次只操作一个电池，每个电池使用一套设备。避免交叉感染;

　　(8) 每次打开或关闭细胞瓶口时，都需要在酒精灯上消毒

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