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“生物过程是发现和制备药物、特殊化学品、大宗能源及化学品的重要手段。先进的检测及控制技术的缺乏极大限制了发酵过程的产率及产能，也对于发酵产物的质量有重要影响。原位拉曼光谱技术是一种可靠的PAT方法，可实现对于发酵过程中营养物、代谢物和产物以及细胞生长参数等指标的在线检测。在线过程分析技术带来的丰富数据可以进一步提升发酵过程工艺水平，并最终实现QbD（质量源于设计）。”
细胞培养是培养细胞获取重组蛋白、抗体等生物大分子生产中的过程，这一过程直接影响到产品的产量及质量。由于细胞培养环境及培养策略会直接影响细胞的生长状况，为保证细胞正常生长、提高产量及保证产品质量，必须监控细胞培养过程。
目前，一般只对发酵过程的工艺参数，如pH、温度、溶氧(DO)、搅拌速度等进行在线检测和控制，而与产品质量密切相关的生化指标仍采用取样分析方式。传统的离线取样存在取样时间间隔较长、分析繁琐等问题，难以满足细胞生长的实时监测与分析要求，因此亟需开发发酵过程中生化指标的离线快速检测或在线检测方法。
图1 发酵过程及关键工艺参数和相关技术指标的检测
PAT技术加速生物过程工艺开发和优化
过程分析技术（PAT）是美国食品和药物管理局（FDA）与欧洲药品管理局（EMA）倡导的制药行业工艺研究与生产的技术。PAT的本质是通过实时测量原料、过程中物料以及过程本身的关键技术指标来实现生产过程的设计、分析和控制。实施PAT能够简化分析过程，为生物制造过程提供连续的工作流程，并为提前发现和解决问题创造可能性。
在线光谱技术是一种现实可行的PAT策略，可以实现实时过程展示，在线参数监测以及过程反馈控制。常见的在线光谱分析方法包括在线近红外 (near-infrared，NIR)、在线中红外(mid-infrared，MIR)、在线拉曼（Raman）光谱等。
图2 梅特勒托利多在线光谱仪： ReactIR™ FTIR（傅里叶变换）光谱仪和ReactRaman™原位拉曼光谱仪
水是细胞培养液的主要成分，在近红外光谱和中红外光谱中吸收较强，培养液中其他成分的红外光谱信息很容易被水的吸收峰掩盖。而水的拉曼信号较弱，相比于红外光谱，拉曼光谱更适合于水体系的分析，其能提供更高特异性的分子指纹信息。因此，拉曼光谱更适合用于生物过程的分析和应用。
拉曼光谱技术可原位同步分析发酵过程中营养物、代谢物和产物的组分浓度变化，借助化学计量学数学模型，甚至可实现同步监测活细胞密度（VCD）、总细胞密度（TCD）、细胞活率（VIB）等生化指标，实现生物过程的实时在线过程监测。
图3 拉曼光谱技术可实现发酵过程的原位在线监控
ReactRaman™ 原位拉曼光谱仪可以在几秒钟内收集和分析光谱，实现对生物过程的密切监控。在定量模型的基础上，研究人员可以对多参数进行快速和同时检测；甚至在整合入生物反应器后，完成某一关键参数或物料流加的反馈控制循环。
基于所关注参数的定量模型，只需根据时刻点的光谱数据即可获取该时刻下对应的所关注指标的数值。相比于传统的离线分析方法，拉曼光谱法可以大大缩短分析时间，这对于研发人员和分析仪器资源的优化具有重要意义。很少的取样量（低至1ml）即可完成对于多种参数的同时快速检测。
图4 使用ReactRaman™原位拉曼光谱仪建立的细胞培养过程葡萄糖浓度和活细胞密度的过程趋势图
发酵体系的原位监测日益成为行业关注的方向。生物反应器广泛用于整个生物制药行业，例如单克隆抗体的制造。在发酵过程中细胞代谢水平可能随时发生波动，代谢物水平可能会明显改变，取样分析带来的滞后性会错过这些过程的表征。
ReactRaman™ 802原位拉曼光谱仪可轻松与生物反应器整合。只需将探头插入反应器中，在高温蒸汽灭菌之后，即可对发酵过程进行全过程连续监测。从过往研究与实际项目经验来看，葡萄糖浓度、乳酸浓度、谷氨酸浓度、谷氨酰胺浓度、乳酸脱氢酶浓度，活细胞密度(VCD)、总细胞密度(TCD)、细胞活率(VIB)等多个指标参数的在线监测均可通过这种方法实现。
对于全过程的连续监测提供了丰富的信息，远远大于取样分析的数据量有助于提升我们对于发酵过程这一“暗室”的充分“可视化”，提升整个工艺的自动化和数字化水平。理论上，ReactRaman™ 802原位拉曼光谱仪可以帮助避免发酵过程的任何异常情况，确保生物反应器始终处于最优的操作条件。工作人员借助实时数据可做出快速决策，从而实现更高的产率和产品质量。
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