一、实验材料: 疾病对应的细胞系(或者是原代细胞),预算充足情况下可以选择2种细胞系,暂定为:A和B细胞
二、实验方案:敲低两种细胞的目的基因1、过表达两种细胞的目的基因1(若是miRNA可以使用mimics、inhibitor)
三、干扰片段筛选:2种细胞都需要筛选(当用mimics和inhibitor时也需要初步筛选表达效果)
目的基因1干扰片段筛选:针对目的基因1设计并合成3条siRNA及NC,转染细胞,QPCR筛选出干扰 的片段进行后续实验;
四、实验分组:A或B细胞
A
A+siRNA NC对照组
A+siRNA目的基因1干扰
A+过表达目标基因1
A+过表达空载
抑制剂处理浓度1
五、检测项目:
细胞增殖或者细胞毒性检测(CCK法/MMT),
流式检测细胞周期,
流式检测细胞凋亡,
细胞侵袭实验(transwell),迁移、划痕
WB检测细胞信号通路中蛋白的表达变化,
QPCR检测信号通路中基因的表达,
免疫荧光检测下游信号通路蛋白
流式多色检测某些marker指标
Coip检测A和B蛋白是否结合
双荧光素酶检测A和B是否结合
油红O染色
生化检测:SOD,CAT等
透射电镜
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