调料九里香保卫细胞壁与新鲜马铃薯块茎新局部化淀粉粒的显微偏振测定分析

偏振光显微镜（PLM）已经成为地质学和材料学领域的常用工具，它通过使用典型的石英楔补偿器、云母1/4波片和Sénarmont补偿，在矿物组成和复合材料（如纤维）结构的测定方面有着举足轻重的作用[1]。上述设备更复杂的组合方式，或涉及利用定量偏振（借助Berek补偿器或Bräce-Köhler补偿器）测定单个各向异性晶体或材料的双折射。或者，可以通过对参照Michel Lévy色表观察到的消光带和光谱进行比较，（事先推断延迟点的样品厚度）用红I（λ）波片测定透射光波的延迟量（以阐明上述结构的双折射）[2]。 

尽管如此，目前PLM在生物结构分析和亚细胞器研究应用上的相对重要性已经下降。相反，基于荧光显微镜技术的方法在生物科学领域的相对重要性得以提高，因为人们充分认识到反射荧光技术（又称超分辨率显微镜技术）在突破阿贝分辨率极限上的作用，而且标记物在荧光蛋白组学成像中广泛应用、使用方便。在本篇短文（希望它短小精悍）中，我们尝试评估显微偏振测定法（传统定量PLM的外推方法）在阐明与鉴别保卫细胞壁超微结构和淀粉粒形态（所述淀粉粒从新鲜马铃薯块茎样品中分离）方面的应用。我们还希望，此后显微偏振测定法作为一种分析技术的优势将得到认识，并随着生物科学和生物影像信息学领域的发展而进一步增强。可以想象，显微偏振测定法与反射荧光技术结合，将在这种背景下形成共振，因为可以通过偏振镜纳米测量技术[自行设计但非常可取的原位蛋白质组学分析的概念，通过整合定量偏振光显微镜（qtPLM）和当今的（或未来的增强版）超分辨率光学纳米显微镜技术平台可能会实现]的解释实现外推。

材料与方法

以新局部化淀粉粒新鲜样品（从马铃薯块茎横切面中分离）为本次评估的阳性对照，源于其来源丰富、易于制备[对于透射明视野（BF）和PLM技术而言]、双折射程度高且结构充分表征的特点。将其与新鲜制备的调料九里香（M. koenigii）下表皮（本文称为远端表皮）载玻片（通过反射PLM观察）进行对比，并以市售骨骼肌原纤维载玻片（双折射程度极低，一般无法通过Berek和de Sénarmont补偿进行解析）为qtPLM的阴性对照（本文不包括该载玻片的观察结果）。以HC PL Fluotar 50X/0.80 BD物镜（徕卡产品代码：566504）结合旋转分析器和聚光镜集成偏振片（用于投射偏振）或者对应的入射光偏振片和史密斯反射立方体（用于反射偏振），进行样品的各向异性鉴别。由于所分析的样品大体具有高度双折射特点，因此利用传统的Berek补偿器进行偏振度定量分析和对象延迟量测定，不过样品的对象延迟量（Γobj）以另外一种方法予以量化（与利用单色光测定Γobj的传统方法相反）。（但是）本短文中de Sénarmont和Bräce-Köhler补偿方法并未用于Γobj或双折射率量化。

结果

图1：透射明视野偏振光下未使用补偿器（A）及使用相应Berek补偿器（B）获得的马铃薯块茎淀粉类图像。淀粉粒存在明显的双折射现象，其Γobj=168.12nm。

图2：A：反射明视野偏振光下未使用相应Berek补偿器获得的调料九里香保卫细胞（具有内陷气孔）图像。保卫细胞纤维素细胞壁出现橙色和黄色多色性（分别以蓝圈和绿圈标出），背景为绿黄色的细胞溶质（Γobj=52.69nm）*注：有趣的是，斯托克斯位移拉曼散射和磷光可能被视为解释这种现象的替代假说，在后者中，已经发现纤维素具有自发荧光现象，在λ=420～430nm处出现最大发射值[3]）。B：Berek补偿PLM成像的保卫细胞细胞壁立体图。在细胞壁外围观察到比中部切片更密的纤维素微纤维分布（比如，是标蓝圈的保卫细胞对的57%/40%=1.425倍）。

讨论

正如我们所料，结果表明马铃薯淀粉粒和保卫细胞纤维素细胞壁在双折射上存在差异。纤维素和直链淀粉（在其被分析的结构中）均以双折射型多糖大纤维的形式出现；各微纤维的空间排列负责使E光相对于O光移相的距离（Γobj），因此对所形成的E矢量场的旋度（∇×E）产生影响，如下面等式➀和➁所示（假设一个呈正弦曲线形式变化的常数B）。

假如从样品发出的E光和O光振幅（A）相同，其E场分别表示为y轴和z轴。那么，明确具有双折射特点的样品[常数λ和外部补偿（若有）为Γcomp]：

其中x表示偏振波在途中经过样品时移动的距离，Γoc=Γobj+Γcomp。

这样一来，（利用自行设计且与背景相关的（但具有广义性）、用于在R3.5中确定双折射率的公式）可以推导出∇×E，如下所示：

其中可以假定光子的量子空间跳跃分别从y1和z1到y2和z2（其中y1→y0+，z1→z0+，y2→y0-，z2→z0-，Ay或Az=A）。

从上面的等式➁可知，在R3.5中∇×E的图是一个曲线超平面，Γoc在∇×E中沿着w轴引入相前平移。正如我们所料，这在视觉上表现为被分析的透射光波（具有不同的Γoc）的交替放大/消光；因此，随后从∇×E图获得的w截面可确定dim（∇×E）且Γcomp已知的Γobj。但是，如果λ和Γoc可变（常见的例子是在qtPLM下观察其结构具有不同双折射率的多色照明样品，比如图1和图2分别显示的淀粉粒和保卫细胞纤维素细胞壁），那么我们可以推测，对于λ1..n中确定的λa及Γcomp1..n中确定的Γcompa，Γcompa处的dim（∇×E），这样便可解释样品中观察到的多色性（负衰减的结果）。

此外，通过单独测定Γobj和量化图2中观察到的多向色分布，或许可以推断，被评估的保卫细胞纤维素细胞壁中主要β（1→4）-糖苷键的相对顺序与气孔长轴相平行（与皮层微管一样），表明这些细胞里纤维素合成酶GT结构域的取向[4]在一定程度上与气孔短轴相垂直。这与使用显微偏振测定法确定图1中淀粉粒α（1→4）-糖苷键径向取向形成鲜明对比（这里直链淀粉为主要成分）。

结论

文献表明，上个世纪五十年代至七十年代开展的大量研究中，均涉及显微偏振测定法在生物分析方面的应用[5],[6]。然而，过去几十年偏振光显微镜技术（作为促进生物学研究的要素）的相对重要性已经减弱，而荧光显微镜技术作为一种生物成像平台正在兴起，并随着超分辨率光学显微镜技术和SIM等的发展而进一步发展。但与需要特定荧光生物标记（如共聚焦激光扫描显微镜技术和目前的光学纳米显微镜技术中所应用的）和/或扫描/光场技术的情形不一样，生物PLM为了解未解析分子结构中可能存在的异常提供了一个途径。不过，创建含有关键热点蛋白质（如p53和PrPSc[7]等）新双折射值的数据库，可能需要掌握大量的专业知识和进行大量的工作。因此，在这方面，透射和反射PLM的复兴将相得益彰，其中显微偏振测定法可用作传统qtPLM方法的外推法。

参考文章