α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1937

产品规格：100管/48样

产品简介：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）属于糖基水解酶家族，可以从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个L-阿拉伯糖分子。该酶在半纤维素降解以及果实的成熟软化过程中有着重要作用。

α-L-Af分解对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚，对-硝基苯酚在400nm处有最大吸收峰，通过测定400nm处吸光值变化可计算得α-L-Af活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1支加入1.37mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂建议分装后-20℃保存一周，避免反复冻融。

2. 标准品：5µmol/mL的对-硝基苯酚。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.1g组织，加入1mL提取液），冰浴匀浆。15000g，4℃离心10min，取上清（若为绿色植物的茎、叶、芽等组织，建议将上清用提取液稀释5倍后检测；若为果肉等组织，上清可直接检测或根据预测定结果稀释相应倍数后检测）置冰上待测。

2. 细菌、细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，离心弃上清后，按照细胞数量10⁴个：提取液体积（mL） 500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后15000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 液体：直接测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2. 将5µmol/mL的对-硝基苯酚标准液用提取液稀释为500、250、125、62.5、31.25、15.625nmol/mL的标准溶液备用。

3. 操作表 (在1.5mL离心管中) ：

三、α-L-Af活性计算

1. 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y＝kx+b，将ΔA带入方程得到x（nmol/mL）。

2. α-L-Af 活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每g样本每小时产生1nmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/g质量）= x×V提取÷W÷T= 2x÷W

（3）按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/10⁴ cell）= x×V提取÷细胞数量（万个）÷T= 2x÷细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每小时产生1nmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/mL）=x×V样÷V样÷T=2x

V提取：提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.06mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5h。

注意事项：

1. A或ΔA大于1.2时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

2. 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定，若浓度过高，建议将样本用提取液稀释适当倍数后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数；若浓度过低，建议在样本提取时增加组织质量。

3. 加入试剂二后，建议5min内读取OD值。