冰冻切片NADH心肌黄酶（NADH-TR）活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

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 冰冻切片NADH心肌黄酶（NADH-TR）活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 冰冻切片NADH心肌黄酶（NADH-TR）活性染色试剂是一种旨在使用人工电子受体染料硝基蓝四氮唑（NBT），受到NADH心肌黄酶催化还原，产生不溶性紫蓝色色素沉淀，来分析冰冻组织样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。主要适用于动物肌肉组织细胞的心肌黄酶活性定性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

心肌黄酶（Diaphorase），又称为硫辛酰胺脱氢酶（lipoamide dehydrogenase），黄递酶，二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氢硫辛酸脱氢酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期从猪心肌中提取，产品又呈现荧光的黄绿色蛋白质，故被称为心肌黄酶。分子量102000至110000。NADH心肌黄酶直接和黄素蛋白（Flavoprotein）反应，释放出氢原子，将氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）还原为还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），传递氢原子给氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作为电子供体，还原人工电子受体，例如染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，包括硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），产生不溶性甲暨色素，由此用于鉴别动物肌肉组织类型。

产品内容

 清理液（Reagent A）           毫升

 染色液（Reagent B）           毫升

 反应液（Reagent C）           毫升

 透亮液A（Reagent D）          毫升

 透亮液B（Reagent E）          毫升

 透亮液C（Reagent F）          毫升

产品说明书              1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反应液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 透亮液（Reagent D）具有挥发性，注意密闭瓶盖；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于反应孵育

中性树脂：用于切片封片

光学显微镜：用于切片染色后观察分析

实验步骤

染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取xx微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升 反应液（Reagent C），混匀后，标记为 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。

1． 取出待测的10微米厚的冰冻组织切片 

2． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个样品表面

3． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

4． 小心加上xx微升  染色工作液，铺满整个切片样品表面

5． 放进37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照

6． 小心移去切片上的 染色工作液

7． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面

8． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

9． 重复实验步骤6至8二次

10． 小心加上xx微升 透亮液A（Reagent D）在切片上，铺满整个切片样品表面

11． 室温下孵育5分钟（注意：根据退色程度，调整孵育时间）

12． 小心移去切片上的 透亮液A（Reagent D）

13． 小心加上xx微升 透亮液B（Reagent E）在切片上，铺满整个切片样品表面

14． 室温下孵育5分钟（注意：根据退色程度，调整孵育时间）

15． 小心移去切片上的 透亮液B（Reagent E）

16． 小心加上xx微升 透亮液C（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

17． 室温下孵育5分钟（注意：根据退色程度，调整孵育时间）

18． 小心移去切片上的 透亮液C（Reagent F）

19． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面

20． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

21． 重复实验步骤19至20二次

22． 放上盖玻片或封片（中性树脂）

23． 即刻在光学显微镜下观察和计数：

表达NADH心肌黄酶的组织细胞为阳性组织细胞

呈现深紫蓝色为I型肌纤维

浅紫蓝色为II型肌纤维

注意事项

1． 本产品为50次操作

2． 操作时，须戴手套

3．  反应液（Reagent C）避免反复冻融

4． 阴性对照时， 染色工作液不含有 反应液（Reagent C）

5． 心肌组织可以用于阳性对照

6． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干

7． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

8． 整个操作，在避光状态下进行

9． 染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整，通常为5至60分钟

10． 使用 透亮液A、B、C时，注意观察去色变化，切莫过度退色

11． 透明+封片处理后，可以强化染色

12． 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察

13． 样品染色后保存，避免光照

14． 染色参考图像见下图

15． 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰