TRAP染色试剂盒说明书

产品简介：

雅吉生物的抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI为底物，细胞内被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚，萘酚与重氮盐偶联生成有色产物，定位于细胞质中，若细胞内的ACP有抗酒石酸的活性，则呈阳性反应。 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP/TRACP)主要存在于正常人肺泡巨噬细胞等部位的TRAP和存在于细胞白血病人脾脏TRAP均在细胞滤泡中，并不释放入血液，血液中TRAP绝大部分来源于破骨细胞。因而测量血液中TRAP可以了解破骨细胞的功能状态。 抗酒石酸酸性磷酸酶为骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物, 测定TRACP有助于了解生理条件和各种病理条件下的骨代谢状况。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶均在细胞滤泡中，并不是释放入血液。血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态。　

TRAP染色试剂盒说明书试剂盒组成：

自备材料：

光学显微镜、染缸、移液器、秒表、冰盒、纯水、载玻片、吸头、一次性手套

适用样本

1. 石蜡切片

2. 冰冻切片

3. 细胞涂片，爬片

4.血涂片等

操作步骤(仅供参考)：

工作液的配制:

1．底物反应液B的配制：使用前用移液器将试剂B2吸入试剂B1中，溶解混匀，配成甲液；将试剂B4吸入试剂B3中，溶解混匀，配成乙液。将甲液和乙液混匀即成底物反应液B。

2．底物反应液C的配制：使用前用移液器将试剂C2吸入试剂C1中，溶解混匀，即成底物反应液C。

3．底物反应液E的配制：使用前用移液器将试剂E2吸入试剂E1中，溶解混匀，即成底物反应液E。

4．底物孵育液的配制：在染色缸中加入30ml蒸馏水，37℃水浴10分钟。将底物反应液B、C、D、E依次加入已预温的蒸馏水中混合并充分混匀。

注意：所有的工作液现配现用，请使用前新鲜配制，配制后立即使用，一次使用完，不可放置。

 TRAP染色试剂盒说明书

样本的染色处理：

一、血涂片及骨髓涂片

1、推片：

取全血或骨髓3ul左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30°角，置于血滴正前方，稍微往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血滴铺完血膜为止。不要太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。

2、固定：

让涂片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液A中固定2-3分钟，水洗30-60秒。

3、孵育：

水洗后还未干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。

4、复染：

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

二、细胞涂片及细胞爬片

1、固定：

将细胞涂片或细胞爬片放入本试剂盒中的固定液A中固定2-3分钟，水洗30-60秒。

2、孵育：

水洗后还未干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。

3、复染：

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

 TRAP染色试剂盒说明书

三、冰冻切片

1、回温：

将保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温5-10分钟。可以放在37℃孵箱中进行回温，或者将切片架放置在一个小盒子中，将盒子置于37℃水浴锅中进行回温。

2、水合：

将回温好的切片，水中浸泡1-2分钟。

3、固定：

让切片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液中固定2-3分钟，水洗30-60秒。

4、孵育：

水洗后还未干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。

5、复染：

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

四、石蜡切片

1、脱蜡：

二甲苯中脱蜡5-10分钟。再换用新鲜的二甲苯脱蜡5-10分钟。

2、浸泡：

无水乙醇浸泡5分钟。再分别用90%、70%乙醇各2分钟。

3、水合：

蒸馏水中浸泡2分钟。

4、孵育：

还未干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。

5、复染：

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

结果分析：

阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆中。

常见问题：

1细胞诱导不成功？

细胞系或原代BMM细胞诱导破骨细胞时，细胞因子的质量很重要。诱导效果不好时可以考虑调整诱导条件，提高RANKL浓度或者尝试是否添加M-CSF。

2.如何判断阳性细胞？

一般不通过形态变化说明，RAW细胞非常形态非常多样，形态变化并不能说明问题。一般认为多核加上TRAP阳性才能说是多核破骨细胞。

 TRAP染色试剂盒说明书

注意事项：

1.TRAP孵育液易失效，本法宜用皮肤穿刺血涂片，晾干后应及时染色；

2.对冰冻切片染色时，应减少切片在室温暴露的时间。

3.样本需新鲜，取材后应立即处理，否则会影响酶的活性。

4.组织固定需在4℃冰箱进行，时间不宜超过24h，否则酶活性会减弱或消失。

5.一般不建议用石蜡切片。如果需要用石蜡切片，组织在石蜡包埋时，温度不宜高于56℃。应使用熔点为52～54℃的石蜡进行浸蜡，浸蜡时间要短，否则酶活性会减弱或消失。

6.石蜡切片不需要固定。

有效期：2-8 ℃避光有效期为三个月

        注：拆封后请尽快使用，有效期为试剂盒未拆封并严格按要求条件保存的有效期。

TRAP染色试剂盒说明书