微孔滤膜过滤法（又称膜过滤法）是指采用一定孔径等级的无菌孔滤膜截留流体里的微生物，然后转移至合适的培养基上进行培养及菌落计数。该过程常被应用于微生物限度检测和无菌检测。与传统平皿涂布法相比，滤膜过滤法具有不受样品体积限制、可洗去抑制物、高灵敏度等优点。

滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目

 

1.滤膜与滤器的灭菌

（1）将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15分钟。前二次煮沸后需换水洗涤2-3次，以除去残留的溶剂。

（2）滤器灭菌，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用纱布和牛皮纸包装好于121℃蒸汽下，高压灭菌20分钟

 

2.分离培养

（1）过滤水样（海水、饮用水、自来水，水库水及各种水源水），用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，使粗糙面向上，贴放于已灭菌的滤器上，稳妥地固定好滤器，将水样注入滤器内，加盖，打开滤器阀门，在负0.4大气压下抽滤，水样抽完后，再抽气5秒钟，关上滤器阀门，取下滤器。

（2）用灭菌摄于夹滤膜边缘，移放在EMB培养基平板培养基上，使滤膜的截留细菌面向上，另一面紧贴培养基，两者之间不得留有气泡，重复以上的步骤，再接种一、二个平板，倒置培养皿于37℃下培养20-24小时。

（3）原理：大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基（EMB培养基）上长出的菌落呈黑色。

 

3.含量（污染程度）的计算

1毫升水样中的大肠杆菌群数等于滤膜上生长的大肠杆菌群的菌落平均数乘以稀释倍数，最后除以样品的毫升数，即得。

例如，无菌操作下将90ml无菌水加入到10ml待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数为45，黑色菌落为5，根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目=5×（1000÷10）=500个。