蛋白质印迹故障排除指南

问题

未检测到分析物。

原因/补救措施

• 检查使用的蛋白质量：布拉德福德测试;
  支链氨基酸法

• 增加蛋白质浓度

• 如果可能，使用抗原表达水平高的阳性对照

• 使用新鲜的裂解缓冲液

• 向样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂

• 将样品储存在冰上 （4°C）

分析物在电泳过程中用完凝胶

• 使用蛋白质分子量标准确保目标蛋白质（kDa）仍在凝胶内。

• 缩短电泳时间

无需从凝胶转移到膜

• 检查蛋白质转移是否成功：丽春红S染色

• 使用上样对照（管家）来确保蛋白质的转移相等。

• 延长传输时间

错误的印迹膜

聚偏氟乙烯

• 需要用甲醇活化

• 高结合能力（170 双 200 μg/cm2）

• 与硝酸纤维素膜相比，更多背景

• 适用于剥离缓冲液和重新探测。

硝基细胞使用

• 结合能力低（80 双 100 μg/cm2）

• 更少的背景

为您的样品选择合适的孔径：

• 0.1， 0.2 或 0.45μm.（0.45μm孔径适用于大多数蛋白质（≥20kDa））

转移条件

• 转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。

• 减少传输时间和/或电流（“过度传输”）。

阻止持续时间

缩短阻塞持续时间

• 室温下1h

封闭剂的选择

抗原掩膜

• 使用较低的浓度

• 使用其他缓冲区

我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。

强力洗涤

• 减少洗涤步骤的次数和/或持续时间

• 3x 5 分钟（室温）

• 降低洗涤剂的浓度

• 0.1-0.5% 吐温 20

一抗错误

确保您选择的抗体适用于蛋白质免疫印迹（数据表）

孵育时间（一抗）

延长孵育时间

• 4°C 过夜

抗体浓度低

• 检查使用的抗体浓度。

• 验证相关性

• 从数据表中所述的较高浓度开始。然后逐步降低注意力。

二抗错误

检查二抗是否与所选的一抗结合（数据表）

辣根过氧化物酶（HRP）活性受到抑制

• 不要在缓冲液中使用叠氮Hua钠。因为它抑制HRP（辣根过氧化物酶）偶联活性。

• 不要使用甘油与ACS等级低于99，5%。因为它抑制HRP（辣根过氧化物酶）偶联活性。

• 避免反复冷冻和解冻抗体溶液。

• 准备小等分试样

抗体储存技巧

ECL试剂已过期

使用新鲜的ECL试剂

ECL试剂污染

使用新鲜的ECL试剂

曝光时间

• 根据抗原表达水平的不同，暴露时间可能会有所不同

• 通过小步骤增加暴露时间

问题

原因/补救措施

高抗原表达水平

降低蛋白质浓度

封闭剂的选择

• 如果需要检测磷酸化蛋白质，请勿使用奶粉。

• 一抗可能与酪蛋白发生交叉反应

• 如果使用链霉亲和素/亲和素偶联物，请勿使用奶粉。

• 牛奶含有内源性生物素

• BSA和奶粉不适用于检测山羊、牛或绵羊的二抗。

• 二抗可能与来自BSA或奶粉的牛免疫球蛋白发生交叉反应

我们建议使用来自同一物种的5%正常血清作为二抗或不含IgG的BSA。

孵育时间（封闭试剂）

延长孵育时间

• 室温下1h

一抗浓度错误

• 降低一抗浓度

• 滴定

二抗浓度错误

• 降低二抗浓度

• 滴定

洗涤

曝光时间

• 增加洗涤步骤的数量和/或持续时间

• 3 x 5分钟 – 5 x 5分钟

• 将吐温 20 添加到洗涤缓冲液中

• (0.1-0.5%)

• 使用振动筛

根据抗原表达水平的不同，暴露时间可能会有所不同

转印膜

• 处理膜时使用镊子

• 膜不应变干

检测试剂

降低底物浓度

问题

原因/补救措施

蛋白质被 降解

• 使用新鲜的裂解物

• 将样品储存在冰上 （4°C）

• 将蛋白酶抑制剂添加到样品缓冲液中

样品条件

• 检测到错误的亚型

• 翻译后修饰

• 分子量变化，可能导致双条带

• 如果可能，使用阳性对照

• 如果可能，使用阴性对照

• 样品和/或缓冲液的细菌污染

• 准备新鲜样品或缓冲液

• 使用去离子水

转印膜

• 转印前去除凝胶和印迹膜之间的任何气泡。

• 在封闭之前快速清洗膜，以去除任何残留的凝胶或SDS。

一抗

• 验证一抗的特异性结合

• 在对照实验中使用不含一抗的二抗。

• 优化抗体浓度（滴定）。