可靠的长时间活细胞成像

本文主要讨论如何使用专门配置的徕卡倒置显微镜和台式细胞培养箱轻松、可靠地研究多孔板中培养的平滑肌细胞（SMC）的划痕愈合情况。血管受损后影响SMC增殖和迁移的信号转导情况在医学研究中有重要意义。由于SMC遍布全身，所以对其迁移情况的研究也有助于癌症和损伤的治疗。

引言

研究人员主要研究血管损伤后及动脉粥样硬化进展过程中控制SMC的增殖和迁移的机制和细胞信号转导情况[1,2]。这些平滑肌细胞和脉管系统遍及全身各部位的每一种组织内，包括但不限于肺部、肠道和大脑。已发表的研究报告已经证实了SMC的增殖和迁移在癌症、眼部损伤以及动脉粥样硬化进展过程相关[1,2]。本文主要讲述如何通过徕卡倒置显微镜和台式细胞培养箱以更加有效、可靠的方式研究多孔板中培养的SMC相关的划痕愈合情况。

挑战

在融合的单层细胞形成划痕时，须随时监测划痕的再生和“愈合"情况，以测定其恢复能力[3]。这就需要一个可靠的成像解决方案，该解决方案应能：1）让细胞存活更长时间，及2）即使在多孔板内成像，也可在成像过程中持续将焦点放在细胞上。

方法

在此研究中，多孔板内贴壁培养的融合单层SMC生成“划痕"。其是由p200移液器吸头造成的。为研究划痕愈合情况，紧接着使用物镜为10x/0.32 NA（数值孔径）的DMi8 倒置显微镜在相差模式下观察细胞生长情况19个小时以上。使用了量子载物台和台式培养箱来培养细胞[4]。载物定位的可再现性功能确保在拍摄多个位置后不会丢失观察位置。自适应焦点控制（AFC）可使物镜“锁定"样本从而保持焦点，因为AFC会主动检查样本和物镜的距离，随时且随板孔的变化保持焦点。每20分钟拍摄一次图像，共有114个时间点。整个过程对3个孔中的划痕区域进行了观察。采集图像后，使用Leica 2D分析软件对其进行处理，计算随着时间推移划痕面积发生的变化。整个实验包括对照共检测了4个不同孔。

结果

图1中，单个位置显示为19小时采集的代表性时间序列，并显示了典型的划痕愈合进展情况。面积随时间的变化分析结果如图1的下半部分所示。图2所示为绘制的4个孔中3个孔随时间变化的曲线，说明划痕愈合的进展情况，即单层细胞在划痕中的再生。

图1：划痕愈合过程中的SMC图像。A-E所示为位置1在A) 0小时、B) 4小时40分、C) 9小时20分、D) 14小时、E) 18小时40分时未处理图像裁剪部分。A’-E’所示为计算划痕愈合率时处理的相应面积，其中黄线表示细胞与开放空间之间的边界。比例尺为200 um。图片由弗吉尼亚大学资深科学家Laura S. Shankman博士提供。

图2：划痕面积随时间变化的曲线说明单层细胞随着时间的推移的恢复情况。在3个单独的孔中监测划痕恢复情况，并将此标记为位置1至3B。位置3A和3B处于同一孔中，但是同一划痕的不同区域。

结论

本研究的结果表明，使用专门配有量子载物台、自适应焦点控制（AFC）和台式培养箱的DMi8 倒置显微镜，可轻松对多孔板中培养的SMC的划痕愈合的过程进行研究。

参考文献

1. L. Shankman, D. Gomez, O. Cherepanova, M. Salmon, G.F. Alencar, R.M. Haskins, P. Swiatlowska, A.A.C. Newman, E.S. Greene, A.C. Straub, B. Isakson, G.J. Randolph, G.K. Owens, KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis, Nat. Med. (2015) vol. 21, pp. 628–637, DOI: 10.1038/nm.3866.

2. O. Cherepanova, D. Gomez, L. Shankman, P. Swiatlowska, J. Williams, O.F. Sarmento, G.F. Alencar, D.L. Hess, M.H. Bevard, E.S. Greene, M. Murgai, S.D. Turner, Y.-J. Geng, S. Bekiranov, J.J. Connelly, A. Tomilin, G.K. Owens, Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective, Nat. Med. (2016) vol. 22, pp. 657–665, DOI: 10.1038/nm.4109.

3. K. Schwab, How can PAULA help streamline the workflow for my wound healing assay? Application for wound healing assays, Science Lab (2019) Leica Microsystems.

4. J. Neumann, A. Scherhag, S. Otten, F. Shen, A.L. Leifke, U. Birk, C. Greb, K. Lucas, C. Cremer, Chronic Inflammation Under the Microscope, Science Lab (2017) Leica Microsystems.