产品推荐:气相|液相|光谱|质谱|电化学|元素分析|水分测定仪|样品前处理|试验机|培养箱


化工仪器网>技术中心>其他文章>正文

欢迎联系我

有什么可以帮您? 在线咨询

不想实验白忙活?高质量荧光成像小技巧学起来

来源:微仪光电(天津)有限公司   2023年03月17日 13:09  

荧光染色是个麻烦的工作流程,辛苦染色样品就为了获得一张好的荧光图片,如果成像没做好、图片没拍好,那真的是血亏、白忙活。为什么要用荧光成像?如何用荧光显微镜拍摄才能获得高质量的荧光成像?今天我们就来给大家介绍一下。

1、荧光成像:现代实验室是不可少的技术

荧光染色工作流相对明场染色复杂,那为什么要用荧光成像呢?首先回归基础概念,荧光是一种光致发光现象,指某些物质(如荧光探针)在一定波长激发光的照射下,在短时间内发出比激发光波长更长、能量更低可见光的现象。

荧光成像具有高灵敏度和高特异性的优势,荧光探针可以特定性标记细胞器等目标,非常适合进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中的分布的观察,共定位和相互作用的研究,离子浓度变化等生命动态过程的追踪等等,广泛应用于细胞生物学、神经生物学、植物学、微生物学、病理学、遗传学等各领域,是现代实验室标配的检测方案、成像方案。

荧光成像一般使用荧光显微镜进行,根据不同的实验目标,需要选择不同型态的荧光显微镜,比如切片类样品或水质检查等高倍观察适合用正置荧光显微镜,培养皿、活细胞类样品适合用倒置荧光显微镜,植物和模式生物等大样品适合用体视荧光显微镜。

 

2、荧光显微镜的两个核心部件

荧光的产生包含激发和发射两个过程,在荧光显微镜中具体体现为荧光光源和激发块两个关键部件,已经都整个在荧光臂(荧光模块)中,没有这两个部件,荧光无从谈起,这两个部件不合适,荧光效果大打折扣。

(1)激发光源:主要包含以下两个指标

光源光谱覆盖发射光谱:荧光探针在特定波段范围才能被激发,因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光探针的激发特征。

发射光谱波段的强度:荧光信号一般较弱,需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。

(2)激发块:用于形成特异性激发/发射的一组滤光片,一般包含以下三个

激发滤光片EX:滤过光源中特定波段的光,用以激发样本中特定荧光探针

发射滤光片EM:允许荧光探针发射的特定波段的光通过

二向分色镜DM:反射激发波段的光,透过发射波段的光。

 

3、成像“宁欠勿曝”是个坑,曝光尽量亮一点

看完上面的资料,大家应该都对荧光显微镜有更好的了解了,下面我们来讲成像拍照部分。

现在的荧光成像拍照基本都是用荧光显微镜搭配显微镜数字相机进行的,但不少教学资料可能还停留在胶片时代,这些资料可能和数字相机不太对得上,典型的就是“宁可欠曝,也不要过曝”,简称“宁欠勿曝”。举个例子,上图是一张JPG格式的欠曝的斑马鱼荧光图片,看起来有点费眼神。

通过后期调整亮度,斑马鱼的信号是增强了,但背景的杂讯和噪点也增强了,看起来很不干净,色彩也出现了断层。

胶片相机擅长表现暗部,因此才有“宁欠勿曝”,而显微镜数字相机相反,不擅长表现暗部,如果图片欠曝,那么有效信号就更可能跟背景噪声混在一起,从而降低了图片的信噪比,成像效果就会不理想。因此对于显微镜数字相机来说,样品信号的曝光尽量亮一点会更好,这可以通过在明美显微成像系统中增加曝光时间或增益实现。

 

4、选择合适的荧光光源和激发块

提升信号亮度

上面我们介绍过,荧光显微镜有两个核心部件,荧光光源和激发块。要提升荧光亮度,除了调整相机的曝光时间和增益,还要选择高光强的荧光光源和合适的滤光片组。荧光光源典型代表是高压汞灯,它可以在特定波长提供非常高的光强,缺点是需要预热,使用寿命较短,且在寿命用尽之前还会有亮度衰减问题,如果你的汞灯亮度不足,建议先看看ND滤镜是不是调错了,如果ND滤镜没错,那可能就是寿命快到了,要换个灯泡或换掉整个荧光光源。

部分资料可能还将金属卤素灯列为荧光光源,虽然卤素灯能覆盖激发光谱,且使用寿命比汞灯更长,但用作荧光光源时光强是不足的,荧光信号弱,不适合用于数字成像。

现在我们有比汞灯和卤素灯都要好的荧光光源,LED荧光光源,比如宽光谱大功率LED荧光光源和四通道光源. LED荧光光源能提供接近汞灯的激发光谱和光强,而且可以即开即用,亮度可以线性调整,省去了预热、调ND滤镜等一系列流程,使用更加方便,而且寿命还能达到汞灯等几十倍甚至上百倍。

激发块用于形成特异性激发/发射光谱,如果激发块的参数和荧光探针的参数不匹配,就会导致样品荧光信号弱,需要切换到合适的激发块解决。另外激发块还有个通光效率的参数,一般进口滤光片组的通光效率要比国产滤光片组好几十个百分比,荧光信号显著更强,背景更暗,信噪比更高,但对应地成本也会高很多,明美选用进口滤光片组装荧光激发块,在保障良好的激发效果前提下,有效降低了成本,并且除了BGUYR等常用波段,还有针对结核检查的宝蓝B2和针对荧光原位杂交FISH的蓝绿双通等特殊配置,大大提升了病理检查等成像应用的效率。

 

5、使用高灵敏度相机和色阶/曲线

提升信噪比

数字相机随着增益值提升和曝光时间的增加,会有不同程度的背景噪声和热噪声问题,使用高灵敏度相机可以用更低的曝光时间实现理想的曝光,这不仅更方便拍摄未固定的样品,还能带来更高的信噪比,因此荧光成像一般推荐用高灵敏度相机。

荧光成像通常多多少少会有背景荧光问题,使用荧光挡板遮挡明场聚光镜,能减少落射荧光成像时的背景荧光,而在数字相机成像时,我们可以通过调整明美显微成像系统的色阶或者曲线设置,实时压低或去除背景荧光信号,再拍照。比如色阶处理中,我们通常把滑条左下的滑块往右调,来去除背景荧光信号,然后将中间滑块往左调,适当补偿样品信号,即可获得高信噪比的成像。

 

6、图片格式用TIFF更保险

在一开始的例子中,我们特别强调了JPG格式,那是不是用其他格式会更好?还真的是。

通过简单后期处理,我们还是可以获得一张能用的样品图。这是因为JPG文件格式会将暗部细节和高光细节等人眼不善于分辨的内容丢掉,来压缩数据量,这里面可能就包含对我们有用的样品细节,而TIF格式可以储存未压缩的原始数据,这些数据经过处理还是有机会用得上的,这也是论文图片通常用TIF格式的原因。

免责声明

  • 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
企业未开通此功能
详询客服 : 0571-87858618