(1)标准的PCR反应条件:
10X缓冲液:10 μL
4种dNTP混合物:各200umol/L
引物:各10~100pmol
模板DNA:0.1~2μg
Taq DNA聚合酶:2.5U
Mg2+ :1.5mmol/L
(2)PCR反应过程:
(3)PCR反应特点:
灵敏度高
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
能从100万个细胞中检出一个靶细胞
病毒检测的灵敏度可达3个RFU
细菌检测的最小检出率为3个细菌
简便、快速
一次性加好反应液,2~4 小时完成扩增
扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
PCR反应体系
以DNA为模板的反应
反应体积:50~100μl
缓冲液
引物
底物:4种dNTP
模板:102~105拷贝
TaqDNA聚合酶
矿物油
以mRNA为模板的反应(逆转录PCR)
逆转录反应体系
体积:20 μl
缓冲液
底物:4种dNTP
引物:oligo(dT)12~18
模板:RNA
逆转录酶
其他试剂:RNA酶抑制剂,
MgCl2.DTT.牛血清白蛋白
PCR反应体系同以DNA模板的反应体系
(一)PCR反应成分
1、模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100mL。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
2、引物浓度
0.1-0.5 mmol/L
浓度过低影响产量,偏高引起错配和非特异性产物增加,且可增加引物二聚体的产生几率。
3、Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)
0.5-2.5 U/50 ml
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
4、dNTP 20~200μmol/L
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量,但特异性增加
dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
5、 Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
6、 PCR反应的缓冲液
10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲液,72℃ 时pH 7.2,调节反应体系的pH值,使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火,大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。
(二)循环参数
1、变性
94oC~95oC,30-60 s
且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5~10min
2、退火
50oC~55oC,60-90 s
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;
降低温度可增加反应的灵敏性。
3、延伸
70oC~74oC,60-120 s
延伸时间由扩增片段长度决定
4、循环次数
主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次
次数过多:非特异扩增增加
(三)PCR产物的积累规律
在PCR反应中,DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期,目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累,扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态,即出现“停滞效应”,又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前,TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。
多数情况下,平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律示意图
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