浅谈影响荧光定量PCR实验结果的几大因素

浅谈影响荧光定量PCR实验结果的几大因素

首先什么是PCR呢？

PCR的全称是聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），是一种体外酶促合成特异DN的方法，也可以称作无细胞分子克隆或DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。它不仅可用于基因分离，克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。

PCR分为定性PCR和定量PCR两类：定性PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析；定量PCR能通过加入的荧光分子信号的变化来实现对PCR产物的实时检测。相对来说，定量PCR的检测灵敏度更高；特异性好，准确性高；线性关系好，范围宽；操作更简单安全。

PCR实验的基本因素及过程反应成分：引物，酶，模板DNA，dNTP，Mg2+镁离子浓度 。

反应过程：1、模板变性；2、引物退火；3、新链延伸。

这三个步骤为一个循环，每一个循环度产物均可作为下一个循环度模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。

除了以上五个主要因素外，还有实验耗材因素和温度因素：

1：首先PCR实验试剂的总体积一般为25ul~100ul，因此所选用的耗材必须是吸附低的；

2：PCR实验需要高温解链，低温合链，中温延伸，因此要求所选用的耗材需要有很好的热传导率；

3：PCR实验需要不断的循环升温，降温，这就要求所选用的耗材必须有良好的气密性；

4：PCR实验还需要循坏的收集数据，需要选用的耗材有良好的均一性。

5：另外根据实验使用仪器的不同，荧光定量实验中荧光读取方式不同，对耗材还有以下不同的要求：

  a:采用顶部荧光照射并于顶部回收荧光的仪器，要求管盖或者封板膜必须是光学透光的性能，同时管壁最好选择不透光材质；

  b：采用侧方荧光照射并于顶部回收荧光的仪器，要求管盖或者封板膜必须是光学透光性，同时管壁也要是高透光的透明材质；

  c：采用侧方荧光照射并于侧方回收荧光的仪器，要求管盖或者封板膜最好选用不透光材质，同时管壁选择高透光的透明材质。