细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞冷冻保存在-196℃液氮中，可以使细胞暂时停止生长并保留细胞特性，以便在需要时再复苏细胞用于实验。同时保存适量的细胞，可以防止细胞在培养过程中因受到污染或其他意外事件导致细胞丢种，起到细胞保种的作用。

细胞冻存和复苏采取“慢冻快融”的原则，慢速冷冻可使细胞内的水份渗出细胞外，减少细胞内形成冰晶的机会；快融以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水份渗入细胞内，再次形成胞内冰晶造成对细胞的损伤。

细胞冻存时需向培养基中加入冷冻保护剂，可保护细胞在冷冻时免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂可根据其是否穿透细胞膜分为渗透性和非渗透性两类：

1.渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2.非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟YI基淀粉等。

（一）细胞冻存一般步骤

1. 准备已灭菌的冻存培养液，并4℃预冷；

2. 选取对数生长期的细胞，弃掉细胞培养液，用细胞消化酶（如胰蛋白酶）进行消化，适时去掉消化液，加入少量新鲜培养液。悬浮生长的细胞不进行消化处理，直接将细胞收集于离心管中离心，1000 rpm，5-10 min；

3. 弃去上清液，逐渐加入适量预冷的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节细胞浓度在5×10⁶～1×10⁷/mL之间；

4. 将上述细胞分装于2 mL冻存管中，每管1-1.5 mL。在冻存管上标明细胞名称、冻存日期和操作者；

5. 冻存：标准的降温速率开始为-1～-2℃/ min，当温度降到-80℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二）细胞复苏一般步骤

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快融化；

2. 从37℃水浴中取出冻存管，在无菌条件下取出细胞，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀，以1000 rpm，5-10 min离心；

4. 弃去上清液，加入适量培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度后接种到培养瓶中，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

（三）注意事项

1. 配制好的细胞冻存液要进行预冷，新鲜配制的冻存液会产生大量的热。

2. 冻存的细胞在半年后，建议取出一只冻存管细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。