建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法。
建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法,共分析了96份玉米中6类真菌毒素的污染情况,为监测饲料质量提供技术指导。称取的样品添加6类真菌毒素同位素内标,以84%乙腈水和50%甲醇水作为提取试剂,以2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱,采用液相色谱-串联质谱进行检测。94份玉米中6类真菌毒素的检出率为98%,单种毒素检出率最高的是伏马毒素B1和B2,高达88%,呕吐毒素和赭曲霉A检出率低,均未检出。伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。建立的6类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确,结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义。
采用94份玉米为样本,对这6类真菌毒素进行检测方法开发。
真菌毒素属于真菌的代谢产物,几乎可以污染所有的农作物,会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等,进而通过食物链的形式影响到人体的健康。已知的真菌毒素多达300种以上,目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的要求,我国已于2017年推出国家强制性标准GB 13078-2017饲料卫生标准,并于2018年实施,其对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉A、伏马毒素B1和B2、T-2毒素等做出明确的检测方法规定和要求。本文采用94份玉米为样本,对这6类真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析。为多毒素的快速检测提供技术支持的同时,也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助。本文采用液相色谱-串联质谱,通过加入同位素内标进行校正的手段,开发6类真菌毒素的检测方法,并对94份玉米样品进行6类真菌毒素的检测及污染情况分析。
真菌毒素、液相色谱-串联质谱、真菌毒素同位素内标
TSQ Quantis液相色谱-串联质谱、KS-7200DE超声波提取仪和TGL-16M高速冷冻离心机
真菌毒素标准品:
黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉A、伏马毒素B1和B2和T-2毒素
真菌毒素同位素内标:
黄曲霉毒素B1同位素内标、呕吐毒素同位素内标、玉米赤霉烯酮同位素内标、赭曲霉A同位素内标、伏马毒素B1同位素内标、伏马毒素B2同位素内标和T-2毒素同位素内标
96份玉米(样品来源于全国近30个省份及地区)
依据我国区域划分方式将94份玉米的分布区域进行汇总统计
区域 | 省份 | 份数 |
华东地区 | 山东、江苏、安徽、浙江、福建、上海 | 22 |
华南地区 | 广东、广西、海南 | 10 |
华中地区 | 湖南、湖北、河南、江西 | 12 |
华北地区 | 北京、天津、河北、山西、内蒙古 | 17 |
西南地区 | 四川、云南、西藏、重庆 | 12 |
西北地区 | 宁夏、新疆、青海、陕西、甘肃 | 10 |
东北地区 | 黑龙江、吉林、辽宁 | 11 |
2.1
色谱柱:Hypersil GOLD C18 (100*2.1 3um)
流动相:2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1
时间 | 流速mL/min | 2mM乙酸铵0.1%甲酸水 | 甲醇 |
0 | 0.3 | 70 | 30 |
1 | 0.3 | 70 | 30 |
3.5 | 0.3 | 30 | 70 |
4 | 0.3 | 30 | 70 |
5 | 0.3 | 5 | 95 |
9 | 0.3 | 5 | 95 |
10 | 0.3 | 70 | 30 |
梯度表2
时间 | 流速mL/min | 水 | 乙腈 |
0 | 0.3 | 70 | 30 |
1 | 0.3 | 70 | 30 |
3.5 | 0.3 | 30 | 70 |
4 | 0.3 | 30 | 70 |
5 | 0.3 | 5 | 95 |
9 | 0.3 | 5 | 95 |
10 | 0.3 | 70 | 30 |
采用ESI离子源,分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描,多反应监测模式(MRM)采集数据,6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见下表:
6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数
注:FB1为伏马毒素B1简写(下同),FB2为伏马毒素B2简写,AFB1为黄曲霉毒素B1简写,OTA为赭曲霉A简写,T-2位T-2毒素简写,DON为呕吐毒素简写,ZON为玉米赤霉烯酮简写;13C为其相应的同位素内标简写。
2.2.1混合标准品配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为2.4ppm、黄曲霉毒素B1浓度为80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、呕吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混标。
2.2.2同位素内标配制:配制伏马毒素B1和B2浓度为240ppb、黄曲霉毒素B1浓度为8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、呕吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素内标混合标准品。
称取5g样品各两份,加入同位素内标100uL,其中一份加入20mL84%乙腈水,另一份加入20mL50%甲醇水,超声波震荡提取20min,6000r/min离心5min,上清液过0.22um有机滤膜,液相色谱-串联质谱检测。
3.结果分析
FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外标及同位素内标的MRM图:
DON和ZON的外标及同位素内标的MRM图:
项目 | FB1 | FB2 | AFB1 | ZON | DON | T-2 | OTA |
添加水平 | 600ng/g | 600ng/g | 20ng/g | 400ng/g | 800ng/g | 400ng/g | 40ng/g |
回收率 | 83.6% | 80.4% | 101.8% | 109.8% | 88.0% | 91.3% | 86.9% |
项目 | 相关系数 | 线性范围/ng | 线性方程 |
FB1 | 0.9991 | 0.19-100 | y = 219.68x - 1206.9 |
FB2 | 0.9996 | 0.19-100 | y = 911.45x - 1989.7 |
AFB1 | 0.9993 | 0.049-40 | y = 61482x + 6.8125 |
ZON | 0.9995 | 0.094-35 | y = 8008.3x - 42517 |
DON | 0.9999 | 2-450 | y = 2755.5x - 796.14 |
T-2 | 0.9994 | 0.1-100 | y = 110254x - 63112 |
OTA | 0.9997 | 0.01-20 | y = 1824.1x + 1.5954 |
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有这6类真菌毒素,10份玉米只含有1类真菌毒素,32份玉米含有2类真菌毒素,44份玉米含有3类真菌毒素,6份玉米含有4类真菌毒素。
污染情况占比图
依据94份样品分布区域进行划分,对6种真菌毒素进行分析汇总(汇总表见下),西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少,污染程度低;华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重;华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高。
3.6.1对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 13078-2017 饲料卫生标准要求进行超限判断(表1),超限样品共计14份,其中9份样品一类真菌毒素超限,剩余5份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素和T-2毒素含量,所有样品均合格;此外,其余样品超限情况如下:伏马毒素B1+B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:3份、2份、11份和3份,其对应的超限率分别为3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
表1 部分饲料原料中6类真菌毒素检测标准及要求
项目 | 产品名称 | 检测标准 | 量 |
黄曲霉毒素B1 | 玉米加工产品、花生饼(粕) | NY/T 2071 | ≤50ug/kg |
赭曲霉A | 谷物及其加工产品 | GB/T 30957 | ≤100ug/kg |
玉米赤霉烯酮 | 玉米及其加工产品 | NY/T 2071 | ≤0.5mg/kg |
呕吐毒素 | 植物性饲料原料 | GB/T 30956 | ≤5mg/kg |
T-2毒素 | 植物性饲料原料 | NY/T 2071 | ≤0.5mg/kg |
伏马毒素B1+2 | 玉米及其加工产品 | NY/T 1970 | ≤60mg/kg |
3.6.2对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总,依据GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素要求进行超限判断(表2),超限样品共计46份,其中25份样品一类真菌毒素超限,剩余21份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素含量,所有样品均合格;此外,其余超限情况如下:黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:4份、35份和28份,其对应的超限率分别为4.3%、37.2%和29.8%。
表2 部分食品中6类真菌毒素检测标准及要求
项目 | 食品类别 | 检验方法 | 量 |
黄曲霉毒素B1 | 玉米、玉米面及玉米制品 | GB 5009.22 | 20ug/kg |
赭曲霉A | 谷物及其制品 | GB 5009.96 | 5.0ug/kg |
玉米赤霉烯酮 | 玉米、玉米面(渣、片) | GB 5009.209 | 60ug/kg |
呕吐毒素 | 玉米、玉米面(渣、片) | GB 5009.111 | 1000ug/kg |
单类毒素分析
由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素,故只对其余四类真菌毒素进行单独分析。
94份玉米中6类毒素污染情况对比图
3.7.1 伏马毒素B1+B2
对96份玉米的伏马毒素B1和B2检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为88份,占比93.6%,检测结果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg,中位值为6.41mg/kg;整体污染水平为10.9mg/kg,阳性污染水平为11.6mg/kg。
3.7.2 黄曲霉毒素B1
对96份玉米的黄曲霉毒素B1检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为29份,占比30.9%,检测结果在2.20ug/kg-76.4ug/kg,中位值为4.58ug/kg;整体污染水平为3.48ug/kg,阳性污染水平为11.3ug/kg。
3.7.3 玉米赤霉烯酮
对96份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg,中位值为98.3mg/kg;整体污染水平为329mg/kg,阳性污染水平为552mg/kg。
3.7.4 呕吐毒素
对96份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为56份,占比59.6%,检测结果在0.1mg/kg-7.0mg/kg,中位值为1.0mg/kg;整体污染水平为0.8mg/kg,阳性污染水平为1.4mg/kg。
目前,从技术角度讲,饲料中真菌毒素检测共涉及到6大类,检测标准4项,前处理方法不一,净化产品各异,对人员、操作、设备要求苛刻,给检测带来严峻的挑战;从污染根源分析,一种真菌可能产生多种毒素,一种原料会受到多种真菌感染,往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素;从现实情况来看,饲料受真菌毒素污染情况较严重,且分布不均匀,需要加强其毒素监测。本文所述的一步法检测,采用直提的方式,同位素校正的手段,在保证结果准确的前提下,降低操作难度,缩短检测周期,同时也控制了实验成本。
综上,本文不仅为饲料中6类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑,同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导,为保证饲料产品的质量提供帮助。
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