GB/T 40462-2021 有机肥料中19种兽药残留量的测定

液相色谱串联质谱法

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专li。本文件的发布机构不承担识别专li的责任。

本文件由中国石油和化学工业联合会提出。

本文件由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC 105)归口。

本文件起草单位：上海海关工业品与原材料检测技术中心、上海市农业科学院、上海化工院检测有限公司、上海交通大学、成都产品质量检验研究院有限责任公司。

本文件主要起草人：孙明星、吴晓红、李思瑾、司文帅、沈国清、冷远鹏、白bing、刘倩、蔡婧、商照聪、颜坤、王鲁梅、王chen、李铭。

警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本文件描述了有机肥料中19种兽药残留量的液相色谱串联质谱测定方法。

本文件适用于有机肥料中金刚烷胺(AMT)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺哒嗪(SDZ)、磺胺甲恶唑

(SMX)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲基嘧啶(SMI)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SM)、磺胺甲氧哒嗪(SMPZ)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDO)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)、诺氟沙星(NFC)、环丙沙星(CFC)、恩诺沙星(EFC)、氧氟沙星(OFC)残留量的测定。

本方法检出限分别为：磺胺噻唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑和磺胺氯哒嗪均为20μg/kg；其余目标物均为5μg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不ke少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 8571复混肥料实验室样品制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中残留的兽药，用Na2EDTA-Mcllvaine溶液及乙腈-乙酸溶液提取，经固相萃取柱净化，用高效液相色谱串联质谱仪进行测定，外标或内标法定量。

5试剂或材料

除非另有说明，仅使用分析纯且符合残留检测要求的试剂。

5.1 水，GB/T 6682，一级。

5.2金刚烷胺、磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氘代诺氟沙星(诺氟沙星-D3)、氘代环丙沙星(环丙沙星-D8)、氘代恩诺沙星(恩诺沙星-D5)标准品：纯度不小于95%。标准品信息见附录A。

5.3甲醇：色谱纯。

5.4甲酸：色谱纯。

5.5 柠檬酸溶液(0.1 mol/L)。称取21.01 g柠檬酸，用水溶解，并定容至1 000 mL。

5.6磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L)。称取71.63 g磷酸氢二钠，用水溶解，并定容至1 000 mL。

5.7 Mcllvaine缓冲溶液：将1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液(5.5)与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液(5.6)混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH值至4.00±0.05。

5.8 Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(0.02 mol/L)：称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mL

Mcllvaine缓冲溶液(5.7)中，使其溶解，然后用纯水5倍稀释，混匀。

5.9乙 腈-乙酸溶液(9+1)：量取90 mL乙腈与10 mL乙酸混合。

5.10甲酸水溶液(0.1%)。准确吸取1 mL甲酸于1000 mL容量瓶中，用水稀释并定容至1 000 mL。

5.11 混合标准储备液(100μg/mL)：分别称取19种适量的兽药标准品(5.2)，用甲醇溶解配制成19种兽药浓度均为100μg/mL的混合标准储备液。

混合标准储备液应在-18℃冰箱中保存，有效期3个月。

5.12混合标准工作液(1μg/mL)：准确吸取混合标准储备液(5.11)10ml转移至1000mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配成1μg/mL混合标准工作液。

混合标准工作液应在4℃下保存，有效期1周。

5.13 氘代同位素内标储备液(100μg/mL)；称取氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星标准品(5.2)，用甲醇溶解配制成3种内标物浓度均为100 μg/mL的标准储备液。

氘代同位素内标储备液应在-18℃冰箱中保存，有效期3个月。

5.14混合内标工作液(5 μg/mL和1 μg/ mL) ：准确吸取适量氘代同位素内标储备液(5.13)，用甲醇稀释配成5μg/mL和1μg/mL的内标工作液。

混合内标工作液应在4℃下保存，有效期1周。

5.15 复溶液：准确吸取6.6 mL的磷酸以及7.4 mL的三乙胺与1 000 mL的水混合，取85 mL混合后的溶液与15mL乙腈混合。

5.16 HLB(亲水/油平衡)固相萃取小柱：如Waters Oasis PRiME HLB 60 mg，3 mL固相萃取柱，或功能相当者。

5.17 滤膜，0.22 μm：如亲水PTFE滤膜或相当者。

5.18有机肥料空白试样：不含待测的19种兽药残留的有机肥料。

注：也可以是经检测空白值在检出限以下的有机肥料样品，并经过二至三次提取(见8.2)后于105℃烘干至与待测样品水分相近。

6仪器设备

6.1 通常实验室仪器。

6.2 试验筛：孔径1.00 mm和2.00 mm。

6.3高效液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。

6.4 氮吹仪：氮气流量1 L/min ~ 20 L/min；水温控制室温+5℃~ 90℃(可调控)。

6.5 天平：感量0.1 mg。

6.6 离心机：转速不低于4 000 r/ min。

6.7 振荡器。

6.8 pH计：测量精度±0.02。

6.9 固相萃取装置。

7试样制备

按照GB/T 8571规定进行。试样制备时应将样品研磨至全部通过1.00 mm试验筛，若样品很难研碎，可研磨至全部通过2.00mm试验筛。试样置于4℃下避光保存。

8试验步骤

8.1平行试验

样品测定和空白试验均平行做两份试验。

8.2 提取

称取(2.00±0.02)g试样(精确至0.001 g)于50 mL离心管中，加入100 μL的5 μg/mL混合内标工作液(5.14)混匀，再加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(5.8) ，混匀后再加入20 mL乙腈-乙酸溶液(5.9)，在振荡器上振摇20 min，在4 000 r/min转速下离心10 min，保留上清液A，用于兽药含量的测定。

8.3 净化

取2 mL上清液A过3 mL固相萃取小柱(5.16)，保持约每秒一滴的流速，准确量取1 mL流出液，再过0.22 μm滤膜，待上机测试。

8.4基质匹配标准曲线的制备

8.4.1外标基质匹配标准溶液制备

取有机肥料空白试样(5.18)，按8.2和8.3规定的步骤处理，在洗脱液中加入混合标准工作液(5.12)，配置浓度为0. 010 μg/mL、0. 020 μg/mL、0. 050 μg/mL、0. 100 μg/mL、0.150 μg/mL及0.200μg/mL的系列标准曲线工作溶液，用液相色谱串联质谱仪测定(测定条件见8.5)。以定量离子的峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。

8.4.2内标基质匹配标准曲线制备

取有机肥料空白试样(5.18)，按8.2和8.3规定的步骤处理，在洗脱液中加人混合标准工作液(5.12)和混合内标工作液(5.14)，配成浓度为0.010 μg/ mL、0.020 μg/ mL、0.050 μg/ mL、0.100 μg/ mL、0.150μg/mL及0.200μg/mL的系列基质匹配标准溶液(内标浓度为0.010μg/mL)，用液相色谱串联质谱仪测定。氧氟沙星和诺氟沙星以氘代诺氟沙星(5.2)为内标；环丙沙星以氘代环丙沙星(5.2)为内标；恩诺沙星以氘代恩诺沙星(5.2)为内标。以诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的定量离子的峰面积和相对应内标物的定量离子峰面积的比值为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制内标基质匹配标准曲线。

8.5 测定条件

8.5.1色谱参考条件

推荐的色谱参考条件如下：

a) 色谱柱：C18柱，如Thermo Hypersil GOLD aQ，100 mm×2.1 mm(i.d.)，1.9 μm，或相同分离功能色谱柱；

  b) 色谱柱温度：30℃；

c) 流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液(5.10)；

d) 流速：0.4 mL/ min；

e) 梯度洗脱：梯度洗脱条件见表1。

f) 进样体积：2 μL。

8.5.2 质谱参考条件

推荐的质谱条件如下：

a) 离子源：电喷雾离子源(ESI)；

b) 扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：选择反应监测；

d) 喷雾电压：3800 V；

e) 离子传输管温度：350℃；

f) 氮气作为鞘气和辅助气，鞘气流速0.42 L/min，辅助气流速1.42 L/ min；

g) 氩气作为碰撞气， 碰撞压力为0.2 Pa；

h) 测试物质母离子、定量/定性离子及相应碰撞能量和锥孔电压见表2。

8.6 定性定量方法

8.6.1 定性方法

在相同实验条件下，被测样品中待测物的保留时间与基质匹配标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内，且被测样品中待测物的离子相对丰度与浓度相近的基质匹配标准溶液中的对应离子相对丰度偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

8.6.2定量方法

取试样溶液和基质匹配标准溶液，做多点校准，外标法和内标法定量计算。诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星(共4种物质)采用内标法定量(或外标法)；金刚烷胺磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑.磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶(共15种物质)采用外标法定量。试样溶液和基质匹配标准溶液中各鲁药的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，超出线性范围需稀释进样测定，低于线性范围应按8.2和8.3步骤提取净化后，准确量取2.5 mL流出液，40℃水浴氮气吹干后用1 mL复溶液(5.15)溶解，过0.22 μm滤膜，待上机测试。19 种兽药残留及3种内标混合标准溶液总离子流图见附录B的图B.1，19种兽药残留及三种内标混合标准溶液选择离子流图见图B.2，空白有机肥料样品中添加回收的选择离子流图见图B.3。

8.7空白试验

除不加试样外，按(8.2~8.5)规定的步骤与测定试样同时进行。

9试验数据处理

试样中被测兽药残留量ω，以质量分数计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，内标法按式(1)计算，外标法按式(2)计算。计算结果应扣除空白值。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留到小数点后两位。

式中：

ω_内标——用内标法测得的试样中被测物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

ρ——内标法(被测物与内标物峰面积之比一 浓度间线性关系)计算的样品制备液中兽药物残留浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

式中：

ω外标——用外标法测得的试样中被测物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

ρ’ ——基质标准工作溶液中被测：物的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

A——试样溶液中被测物的色谱峰面积；

As——基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；

V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

10 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值(百分率)，应不大于表4中的相应数值。

11试验报告

试验报告中应包含样品名称、样品规格型号、标准名称和编号、检测日期、检测条件、检测数据等内容，格式见附录C。