导读

人的角膜是眼睛的光学窗口，同时也是眼部药物传递的个生理屏障。目前用于治疗眼部角膜磨损的药物配方，其使用的体外动物模型不能准确地在结构和成分方面代表人类角膜，因此需要进行大量的测试，这种动物体外模型测试成本昂贵，而且也无法准确地预测临床试验中人类的药物反应。3D生物打印是一种增材制造技术，细胞被封装在“生物墨水”中，模拟天然细胞外基质（ECM），随后以逐层方式沉积到的几何形状，因此，基于体外的3D生物打印在眼部药物开发相关中构建角膜模型等方面具有空间精准且降低成本的巨大优势。

文献解读：

与传统的2D培养方法不同，3D打印支架模型制造的方法可以在各个方向促进增殖和球体的形成。2D培养环境可能在组织工程领域更相关，因为研究表明，2D所产生的细胞培养与其体内的表型在形态和生理上都不同。这些观察结果是由于基因表达和信号转导级联导致的细胞反应可能不能预测人体将发生的事情。因此，利用一种细胞反应被最准确地再现的培养系统在组织再生中是非常重要的，尤其是3D生物打印培养模型在生理相关提供更多的预测数据而获得了越来越多的认可，并且降低了药物筛选进行体外测试的经济成本，这允许利用大量体外患者特异性药物测试来减少不可预见的不良反应的风险，从而更准确地预测体内反应。

实验流程及结果：

在Shallu等人的研究中，设计了一种角膜等效物的高通量三维生物打印，这可能会解决体外模型的需要。在该3D角膜模型中，成人角膜的平均尺寸被转换为3D形状，然后转换为G-code文件，由BIOX打印机（CELLINK）打印。为了保持角膜的曲率，采用立体光刻印刷机设计了一个支撑支架模型，该模型可以促进6-12个角膜的打印，从而实现高通量打印。将人角膜角质细胞（HCKs）加入到优化后的生物墨水中，并打印出负载细胞的角膜基质等效物。打印后的结构用100 mM的氯化钙交联，用Hanks平衡盐溶液洗涤，在成纤维细胞培养基中37°C孵育。

▲ 图 1. 人角膜基质和基底支撑支架模型的构建。(a在Autodesk Fusion 360中建模的角膜基质平均尺寸。(b)单孔模型的明场图像及半径。(c)6孔角膜模型的3D模型。(d)用预制软件制备12的打印模型。(e)12孔角膜模型的打印路径。(f)用BIOX打印机对12个角膜进行高通量打印。(g)交联后，放置在介质中，打印出的角膜。(h)通过字母“c”显示其透明的角膜图片。(i)使用倒置显微镜拍摄的3D打印的明场角膜图像。

对打印出的角膜进行活死试验、Alamar试验以及纤维连接蛋白和肌动蛋白绿色标记物的表达进行分析。打印出来的眼角膜能够保持其结构、完整性和清晰度。活死试验和Alamar试验表明，HCKs在2周内保持了高活力（>95%）。打印角膜中的细胞显示纤维连接蛋白和肌动蛋白绿色的表达。

▲ 图 2. 评价3D生物打印角膜的细胞活力和免疫荧光染色。(图a) 在第1天对携带人角膜角化细胞（HCKs）的3D打印角膜进行活死实验（合并图像）。(图b) 在第14天，在携带HCK细胞的3D打印角膜中进行活死实验（合并图像）。(图c) 第1、5、10和14天在3D打印角膜上的Alamar检测。使用荧光显微镜对3D打印的角膜进行免疫荧光染色，以检测纤维连接蛋白（红色（图d）） 、f-actin（绿色（图e））、DAPI（蓝色（图f））和合并图像（图g）。

仪器使用：CELLINK BIOX

总结：

该研究设计了一个高通量3D打印模型，并为快速打印角膜基质模型的可行性建立了方法学。并且优化了由胶原蛋白、明胶和海藻酸钠在生物墨水中的比例配方，打印的角膜透明、光滑，具有所需的曲率，并支持HCKs生长2周。本研究为优化和设计高度组织和仿生结构，结合组成和组件设计提供了一条新的途径，从而可获得大规模的3D打印组织模型。