冰冻切片原理及方法介绍

实验方法原理：冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

实验材料：新鲜组织

试剂、试剂盒：H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性树胶

仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜

实验步骤：

一取材

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

二速冻

1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三固定

1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以wanquan覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。

四切片

1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。

4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。

五免疫荧光染色

1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。