细胞冻存操作方法与注意事项

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来源：天津研晟科技有限公司 2022年12月09日 13:10

　　我们经常遇到过这个问题：自己养的细胞开始长的还挺好的，可是冻存之后复苏会发现细胞状态不好甚至复苏不起来。出现这种问题很有可能就是你的冻存环节出了问题。

　　当细胞冷到零度以下时，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶的大小对细胞有影响是不同的，大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，因此就会造成我们复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存前的状态相差甚远。那么我们要怎么解决这些问题呢？

　　首先我们在冻存的过程中要减少冰晶的形成，尤其是大冰晶的形成：缓慢冻存细胞，可使细胞内避免产生大的冰晶。

　　那么我们该怎样冻存细胞呢？

　　一、慢冻细胞

　　1、常规程序：

　　使用程序降温盒

　　当温度在-25℃以上时，1-2℃/min。

　　当温度在-25℃以下时，5-10℃/min。

　　当温度达到-100℃时，可迅速转入液氮中。

　　2、简易程序：

　　冷冻管管口朝上，放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟下降1-2℃的速度，在40min内降至液氮表面过夜，次晨投入液氮中。

　　3、传统程序：

　　冷冻管置于4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h（或隔夜），液氮长期储存。

　　二、低温保护剂

　　常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

　　三、细胞冻存方法

　　1、预先配制冻存液：

　　冻存液比例多种，根据细胞的特性进行调整冻存液的比例：

　　5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基础培养液；

　　2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗1-2次；去掉培养瓶里的残余血清；

　　3、加入适量胰酶（浓度一般为0.25%），使胰酶覆盖整个瓶，放入培养箱消化；

　　4、细胞消化0.5-2min（具体时间根据镜下形态判断），显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，细胞间不再连接成片，此时加入培养基终止消化；

　　5、用巴氏吸管轻轻吹打细胞，形成细胞悬液，将细胞悬液1000r/min左右条件下离心3-5min；

　　6、弃上清，加入适量预先配制好的冻存液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中的细胞最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

　　7、将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5ml；

　　8、冻存管标记细胞名称，冻存时间，操作者及细胞代数信息。

　　对于悬浮细胞冻存，则直接收集离心细胞，除去胰酶消化的步骤，其他步骤相同。

　　注意事项

　　1、需冻存保种的细胞应在生长良好且存活率高，其密度约为80-90％的状态。细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染。

　　2、在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，所以过程一定要慢。冻存或者复苏最好用新配制的培养液。

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