使用方法
一、储存液和工作液制备
1)储存液制备:用Hepe缓冲盐溶液(50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl)溶解Dispase II冻干粉,配制成10mg/ml的储存液,用0.22µM滤膜过滤除菌。本储存液置于2-8℃,2周稳定;根据单次用量分装冻存,高达2个月稳定,避免反复冻融。
2)工作液制备:使用时用合适的细胞培养液将储存液稀释到工作液浓度即可,常用工作浓度为0.6-2.4 U/ml。不推荐使用>2.4 U/ml的工作浓度。具体使用浓度请根据自身实验体系或参考文献来调整。
二、组织分离
1)用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4mm小片,之后用无菌PBS缓冲液清洗组织片几次;
2)用Dispase II工作液(0.6-2.4 U/ml)浸没并37℃孵育进行组织解离;
3)置于水平摇床上,低速转动,37℃孵育直至组织 完/全 解离;【注意】:第一次使用Dispase II,通过细胞计数来确定总反应时间。对于坚硬致密组织需要1h的孵育时间,不过孵育时间几小时也不会有副作用。
4)若有需要,将消化产物用无菌不锈钢网过筛,从而分离解散细胞和残留组织,或当更大片段组织静置到管底,轻轻倒出上层细胞。若需要进一步解离,则加入新鲜的Dispase II工作液到残留组织。
5)低速离心收集细胞,吸掉酶工作液;
6)用适当的细胞培养液重悬细胞,置于正常预优化条件下培养。
三、细胞亚培养
1)用37℃预热的Dispase II工作液完/全覆盖细胞,置于37℃孵育5min;
2)吸掉溶液,于37℃再孵育10min;
3)显微镜观察以确定消化情况,若有需要,可再孵育15min;
4)用细胞培养液重悬细胞,低速离心并用培养基清洗细胞几次;
5)用新鲜细胞培养液重悬细胞;
6)按照常规方法进行分盘传代。
注意事项
1)Dispase是Godo Shusei Co., Ltd.的注册商标。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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