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反相色谱仍然是色谱工作者“武器库”中最有价值的工具之一。这是一种广为人知的技术，依赖于分析物和固定相之间的疏水相互作用。对于完整蛋白质，该技术使用有机溶剂梯度作为流动相，通常使用离子对试剂。在这些条件下，分子很可能发生变性。这是一种灵敏的分析技术，因为样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白质的精确质量。
对于大分子蛋白质（例如单克隆抗体），甚至对于较小的片段（例如重链和轻链或 IgG 分子的 Fab 和 Fc 区域），推荐使用大孔径色谱柱。安捷伦能够提供多种配置的 300 Å 和 450 Å 产品，包括全多孔、采用表面多孔颗粒的 Poroshell 技术以及一系列烷基键合相。键合相通常具有较短的碳链长度（C8 或 C4/C3）或具有更多独特的配体，例如可提供不同选择性的二苯基。由于反相色谱分析准确度高，因此可以使用完整蛋白质和片段分析来比较生物治疗药物的生物仿制药与原研药。然而，始终需要执行额外的测试以鉴定可能检出的不同异构体的具体位置。
色谱柱选择
选择用于完整蛋白质分析的反相色谱柱时需要考虑多个相互关联的因素：样品分子量和最适合的填料孔径，色谱柱固定相，所用的仪器（特别是检测器的类型），流动相条件，以及速度或通量要求等。
分析物分子越大，则需要越大的孔径。除一些例外情况，用于完整蛋白质分析的孔径通常为 300–500 Å。根据经验，孔径至少应为蛋白质流体动力学半径的三倍。AdvanceBio RP-mAb 色谱柱具有 450 Å 的孔径，ZORBAX RRHD 300 Å、ZORBAX 300SB 和 Poroshell 300 均具有 300 Å 的孔径，而 PLRP-S 提供多种孔径。虽然 1000 Å 的 5 µm PLRP-S 色谱柱孔径明显大于常用于完整蛋白质分析的色谱柱，但是该色谱柱可为完整蛋白质和蛋白质片段分析提供优异的结果。
对于反相色谱柱，选择色谱柱固定相的通用指南是，分子量越大，使用的烷基链应越短。因此，C18 色谱柱常用于多肽分析，而 C8、C4 和 C3 色谱柱常用于完整蛋白质分离。除线性烷基链以外，AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 和 ZORBAX 300SB 色谱柱可提供二苯基固定相。有时，二苯基固定相的不同选择性可提供所需的分离。PLRP-S 是一种聚合物填料而不是硅胶基填料。它提供典型的反相分离以及略有不同的选择性和宽 pH 耐受性。
此外，本篇应用文集中还包含 AdvanceBio RP mAb、PLRP-S、AdvanceBio HIC、ZORBAX RRHD 300SB 等应用简报供您查阅，为生物治疗药物关键质量属性提供新方法，新思路。
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