手机版
化工仪器网手机版
化工仪器网小程序
官方微信
公众号：chem17
扫码关注视频号
本篇文集将会深入浅出介绍电荷异构体分析，进而“柱”力提高生物药行业关键质量属性。
用于生物分子分析的离子交换(IEX)色谱
提高生物治疗性药物电荷变异体分析
蛋白质由含有许多氨基酸的链组成，其中几种氨基酸具有酸性或碱性侧链基团。因此，蛋白质表面上的总电荷可以通过调节周围溶液的 pH 来控制。等电点 pI 是蛋白质的净电荷为中性时的 pH（正电荷数量等于负电荷数量）。如果 pH 低于 pI，则蛋白质总电荷为正，可以保留在带负电荷的阳离子交换吸附剂上；如果 pH 高于 pI，则蛋白质总电荷为负，可以保留在阴离子交换吸附剂上。
图 1. pH 值对蛋白质净电荷的影响
由于大多数蛋白质所含的碱性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多数电荷异构体分离需要采用阳离子交换。然而，每种蛋白质都不相同，找到能够实现所需佳分辨率的条件可能需要相当多的优化工作。强阳离子交换柱通常更易于使用，但对于单克隆抗体，弱阳离子交换柱可能是实现所需分离度的唯一途径。
在开始方法开发之前，确定目标蛋白质的等电点 (pI) 是至关重要的。如果初始流动相条件的 pH 值过分接近蛋白质的 pI，蛋白质就不会保留在色谱柱上。pH 与主要物质的等电点之间的差距应为至少 0.5 至 2 个 pH 单位，具体取决于电荷异构体 pI 的差异。蛋白质可以通过盐梯度（用高离子强度破坏蛋白质在色谱柱上的吸附）或 pH 梯度（蛋白质在 pH 等于 pI 时洗脱）洗脱。
图 2. 阳离子交换的分离机制
基于离子电荷的分离通常在非变性条件下进行
离子交换是一种广泛使用的方法，根据离子电荷的差异分离生物分子。它是一种温和的非变性技术，不需要有机溶剂，因此经常用于表征天然或活性形式的蛋白质，也用于纯化。
值得考虑采用一种能够在方法开发过程中筛选几种不同色谱柱的仪器。即使是离子强度和 pH 等方法条件的微小变化，也很难预测会产生怎样的结果；这两个因素都会影响蛋白质上的净电荷，如果是弱离子交换色谱柱，还会影响色谱柱上的净电荷。建议采用严格的“质量源于设计”方针。建议使用开发矩阵或系统化设计实验的软件。缓冲液顾问软件可以利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱的四元 HPLC 泵功能，从而为方法开发节约大量时间。
因此，离子交换技术适用于分离具有不同等电点的蛋白质，但它在分离单个蛋白质的带电异构体方面同样很有价值。在越来越重要的生物制药领域，蛋白质通过生物工程生产并从发酵反应中分离出来，带电异构体表示着蛋白质的一级结构存在差异，因此带电异构体的鉴定非常重要。一级结构的差异可能说明糖基化或降解途径有所变化，例如 C 端残基缺失或酰胺化/脱酰胺化作用。它们还可能导致稳定性或活性发生改变，并可能引起不良免疫反应。离子交换用于在开发过程中分离和量化电荷异构体，也用于生物治疗药物生产过程中的质量控制和质量保证。对于单克隆抗体 (mAb) 等大分子，还需要考虑分子的大小和结构（mAb 通常为 150 kD），特别是当色谱相互作用只会发生在表面电荷上时。
图 3. 通过不同程度的氨基酸糖基化、脱酰胺化和氧化作用，以及重链的赖氨酸截短生成的单克隆抗体的电荷异构体
Agilent Bio MAb HPLC 色谱柱
从内到外的优越性能
填料、涂层和键合能够耐高压，有助于实现更高的分离度和更快速的分离
亲水聚合物层消除了大多数非特异性键合
高度均一、致密填装的弱阳离子交换 (WCX) 功能团化学键合到亲水聚合物层上
订购信息
安捷伦色谱柱选择 - 离子交换(IEX)
此外，本篇应用文集中还包含利妥昔单抗创新药物与生物仿制药 mAb 的电荷异质性分析、使用 4D-LC/MS 对单克隆抗体电荷异构体进行全自动化表征等应用简报供您查阅。
“码”上下载
活动规则：扫描如下二维码，即可免费领取安捷伦生物色谱柱电荷异构体分析应用文集。
免责声明
- 凡本网注明“来源：化工仪器网”的所有作品，均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品，未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的，应在授权范围内使用，并注明“来源：化工仪器网”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源（非化工仪器网）的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品第一来源，并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。
采购中心
