动脉粥样硬化病变的非随机分布与不同的血流模式和作用于血管壁的血流动力学有关。血管内皮细胞不断暴露于不同的流动模式和剪切应力，包括低剪切应力和振荡剪切应力（OSS）的扰动流和相对高剪切应力的脉动流（PSS），导致对血管壁产生不同的影响。PSS 通常具有抗炎和抗动脉粥样硬化的作用，而 OSS 的扰动流会促进动脉粥样硬化的形成和进展。

之前的研究表明，ECs 能够将 OSS 感知为一种机械信号，以诱导骨形态发生蛋白受体（BMPR）相关的 Smad1/5 的力特异性激活，从而导致细胞周期蛋白A 的上调和 p21 和 p27 的下调，从而增加 EC 细胞周期进程和增殖。因此，Smads 的力特异性激活可能是一种有前途的基于血流动力学的分子靶点，可用于干预与血流紊乱相关的血管疾病，如动脉粥样硬化。

据报道，石榴提取物（PE）通过降低循环中的低密度脂蛋白水平和巨噬细胞衍生的泡沫细胞的形成来发挥抗动脉粥样硬化的作用。长期补充 PE 通过上调内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达和调节 ECs 中氧化敏感基因的表达来抑制 OSS 相关的动脉粥样硬化。然而，石榴皮多酚（PPP）的提取物及其纯化的化合物安石榴甙（punicalagin，PU）是否对OSS诱导的血管功能障碍具有改善作用，从而防止动脉粥样硬化尚不清楚。

在北京大学医学部基础医学院药理学系、新疆医科大学药学院、国家卫生研究院（中国台湾）、香港中文大学生物医学学院的一项联合研究中，证明了 PU 是 PPP 的生物活性抗动脉粥样硬化成分，并进一步研究了 PPP 和 PU在体外和体内OSS 诱导的 EC 功能障碍和炎症相关 VSMC 病理生理反应中的作用。该研究提供了新的信息，表明 PPP 和 PU 作为治疗动脉粥样硬化的新治疗成分可能具有很大的潜力。

首先，En face免疫染色显示，用 750 mg/kg的PPP 处理可使小鼠主动脉中油红 O-染色斑块的面积减少 56%，而 250 mg/kg 和 500 mg/kg 的 PPP 使斑块面积减少 23% 和 37%。这些数据表明，PPP在体内以剂量依赖性方式发挥抗动脉粥样硬化作用。

主动脉根部病变面积是主动脉瓣狭窄的重要参数，与动脉粥样硬化斑块的严重程度相关。因此，在主动脉根部的横截面中进一步测量了斑块面积。结果表明，在 PPP 处理的低密度脂蛋白受体敲除（LDLR^–/– ）小鼠的病变区域中，Mac-2 染色的巨噬细胞含量显著减少，表明 PPP 减轻了斑块中炎性巨噬细胞的浸润。

脂质代谢紊乱被认为在动脉粥样硬化的进展中起重要作用。用 750 mg/kg 或 500 mg/kg PPP处理 LDLR^–/– 小鼠显著降低了血浆甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的水平。

由于 PU 是 PPP 中的主要生物活性化合物，因此研究了 PU 处理是否对动脉粥样硬化产生与 PPP 相似的保护作用。结果表明，PU的效果与 PPP 类似。此外，PU 处理还降低了 HFD 喂养的 LDLR^–/– 小鼠的血浆 TC 和 TG 浓度而不影响体重。这些结果表明，PU 是 PPP 中主要的活性抗动脉粥样硬化成分。

PPP 和 PU 发挥内皮依赖性血管保护作用

然后实验研究了 PPP 和 PU 是否可以通过改善血管功能发挥超出上述作用的动脉粥样硬化保护作用。ECs 在正常生理条件下会受到规则的层流剪切应力，通过持续激活 eNOS 来刺激一氧化氮（NO）的释放。然而，由于OSS的存在，eNOS活性在扰动剪应力处降低。

结果表明，PPP和PU对PE引起的血管收缩有舒张作用，当主动脉用 eNOS 抑制剂 L-NAME处理或剥离主动脉内皮时，这种作用消失，证明PPP和PU的血管舒张作用是内皮依赖性的（图1 A-D）。这些结果表明，PPP和PU可能通过改善内皮功能发挥动脉粥样硬化保护作用。

图1   PPP和PU的内皮依赖性血管保护作用。

（A-D）PPP（A）和PU（C）的内皮依赖性血管保护作用和定量结果（B，D）。

PPP 和 PU 抑制体内扰动流诱导的血管内皮中 Smad1/5 的激活

之前的研究表明，在狭窄后的部位，当局部血流被OSS（0.5 ± 4 dynes/cm2）干扰时，扰动流可以在狭窄后的部位诱导磷酸化-Smad1/5 的力特异性激活。因此，实验研究了 PPP 和 PU 是否可以调节 Smad1/5在体内狭窄后位点的这种力特异性激活。使用 U 形夹对大鼠腹主动脉进行收缩（图2 A），对缩窄的主动脉连续切片的免疫组织化学检查表明，狭窄后的部位在管腔 EC 层中表现出高水平的磷酸化-Smad1/5 。相比之下，在收缩的上游和中间点几乎没有可检测到的磷酸化-Smad1/5 染色（图2 B）。用 PPP 或 PU 处理显著降低了由狭窄后位点的流动紊乱引起的磷酸化-Smad1/5 的升高（图2 C、D）。这些结果表明，PPP 和 PU 可有效抑制体内扰动流诱导的 ECs 中 Smad1/5 的力特异性激活。

图2   PPP和PU抑制由体内扰动流诱导的EC中Smad1 / 5的力特异性激活。

（A）通过使用U型夹部分收缩大鼠腹主动脉，建立了腹主动脉狭窄的大鼠模型。采用免疫荧光染色法检测磷酸化-Smad1/5/vWF/SMα-肌动蛋白在收缩部位上游、中点和下游区域的蛋白表达。（B）生理盐水对照组（C）PPP处理组（D）PU处理组。

PPP 和 PU在体外抑制 OSS 诱导的 ECs 中的 Smad1/5 磷酸化

接下来进一步测试了 PPP 或 PU 对 ECs 中 Smad1/5 激活的影响，以响应 OSS 的干扰流。将 OSS 应用于 ECs 可在 24 h 内诱导 Smad1/5 的持续磷酸化。与静态对照相比，OSS 迅速（4 h）诱导 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化，并在 24 h 后保持升高。这种 OSS 诱导的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化在 PPP 或 PU 处理后标准化为基础水平（图3 A、B）。

先前的研究表明，OSS 诱导的 ECs 中 Smad1/5 的激活是通过激活 BMPRs 来实现的。因此，用骨形态发生蛋白（BMP）处理 ECs 30 分钟以激活 BMPR 及其下游 Smads 作为对照实验，以探索 PPP 和 PU 对 ECs 中 BMP 引发的信号传导的影响。结果表明，PPP 和 PU 显著抑制了 BMP 诱导的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化（图3 C）。

图3   PPP 和 PU 可抑制由OSS 或 BMP 诱导的 ECs中 Smad1/5 的激活。

（A-C）蛋白质印迹分析由OSS诱导的ECs中指示分子的蛋白质表达4小时（A）或24小时（B），BMP诱导30分钟（C）。

PPP 和 PU 抑制 OSS 诱导的 ECs 促炎反应

EC炎症是动脉粥样硬化发病的早期事件，OSS通过触发TNF-α等信号分子的释放来激活EC促炎反应，从而促进动脉粥样硬化进展。因此，用 OSS 或 TNF-α处理 ECs 4 h 以刺激 ECs 的促炎状态，并检查 PPP 或 PU 的作用。结果表明，PPP 和 PU 对 OSS 诱导的 ECs 促炎反应具有抑制作用。

PPP 和 PU 抑制 OSS 诱导的 EC 增殖

OSS 诱导的炎症促进了 ECs 的增殖。在暴露于 OSS 24 h后，数据表明，PPP 和 PU 可以抑制 Smad1/5 的力特异性激活，从而减弱由 OSS 干扰流动诱导的促炎反应和 ECs 增殖。

PPP 和 PU 抑制 TNF-α 诱导的 VSMC 迁移、表型调节和促炎反应

由于 VSMCs 的迁移、增殖和表型调节是导致动脉粥样硬化进展的关键因素，因此使用伤口愈合实验检测了 PPP 和 PU 对 TNF-α 诱导的 VSMCs 迁移的影响。结果表明，PPP和PU抑制了TNF-α诱导的VSMCs迁移（图4 A）。为了进一步探索 PU 对 VSMCs 表型调节的影响，测定了收缩性 VSMCs 标记物，即 SMα-actin 的基因表达（图4 B）。结果表明 SMα-actin 表达被 TNF-α 降低，并且这种作用被 PU 处理逆转。VSMCs 的合成表型可释放促炎性 IL-6，而 c-fos 可促进 VSMCs 增殖。实验发现，PU 抑制 TNF-α 诱导的 VSMCs 中 IL-6 和 c-fos 的表达（图4 C）。这些结果表明，PPP 和 PU 可以保护VSMCs中 TNF-α 诱导的增殖、迁移、炎症和表型调节。所有这些反应都参与了动脉粥样硬化的进展。

图4   PPP和PU抑制TNF-α诱导的VSMCs的迁移，表型调节和炎症。

（A）通过伤口愈合试验检测VSMCs的迁移。（B）蛋白质印迹分析及PU对VSMCs中α-SMA表达的影响的定量结果。（C）对IL-6和c-fos mRNA表达的实时荧光定量PCR结果。

总之，该研究证明 PPP 和 PU 通过抑制 OSS 诱导的增殖和炎症来保护 EC 功能障碍。PPP 和 PU 的这些保护作用可能是由于它们抑制了 ECs 中 Smad1/5 的力特异性激活。此外，目前的结果表明，PPP 和 PU 可以在促炎刺激下抑制 VSMCs 的炎症、迁移和表型调节。研究结果为 PPP 和 PU 抑制受干扰流/炎症诱导的 EC 功能障碍和 VSMC 增殖、迁移和表型调节，进而抑制动脉粥样硬化的机制提供了新的见解。

参考文献：Anwaier G, Lian G, Ma GZ, Shen WL, Lee CI, Lee PL, Chang ZY, Wang YX, Tian XY, Gao XL, Chiu JJ, Qi R. Punicalagin Attenuates Disturbed Flow-Induced Vascular Dysfunction by Inhibiting Force-Specific Activation of Smad1/5. Front Cell Dev Biol. 2021 Jun 28;9:697539. doi: 10.3389/fcell.2021.697539. PMID: 34262908; PMCID: PMC8273543.

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