GB 31658.6-2021 食品安全国家标准

动物性食品中四环素类药物残留量的测定

高效液相色谱法

前言

本文件按照GB/T1.1-2020<《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件系首ci发布。

1范围

本文件规定了动物性食品中四环素类药物残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。

本文件适用于猪、牛、羊、鸡的肌肉、肝脏和肾脏，猪、鸡的皮+脂肪，鸡蛋，牛奶，鱼皮+肉，虾肌肉中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不ke少的条款。其中，注日期引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改dan）适用于本文件。

GB/T 6682分析实险室用水规格和试验方法。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试料中残留的的四环素类药物，经EDFA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，高效液相色谱紫外法测定，外标法定量。

5试剂与材料

以下所用的试剂，际特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

5.1 试剂

5.1.1甲醇(CH3OH)：色谱纯。

5.1.2 乙腈(CH3CN)：色谱纯。

5.1.3 三氟yi酸(CF3COOH)。

5.1.4二氯甲烷(CH2Cl2)。

5.1.5 乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2O8)。

5.1.6 枸橼酸(C6H8O7·H2O)。

5.1.7 磷酸氢二钠(NaH2PO4•12H2O)

5.1.8 草酸(H2C2O4•2H2O)。

5.1.9硫酸(H2SO4)。

5.1.10钨酸钠(Na2WO4)。

5.2标准品

盐酸土霉素含量≥97.0%，盐酸四环素含量≥97.5%，盐酸金霉素含量≥93.1%，盐酸多西环素含量≥98. 2%，见附录A。

5.3溶液配制

5.3.1柠檬酸溶液：取柠檬酸 21. 01 g，用水溶解并稀释至1 000 ml。

5.3.2磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠71. 63 g，用水溶解并稀释至1 000 ml。

5.3. 3 Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)：取枸橼酸溶液1 000 mL，磷酸氢二钠溶液625 mL，混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4. 0±0.05。

5.3.4 EDTA•2Na-Mcllvaine缓冲溶液：取乙二胺四乙酸二钠60.5 g， 加Mcllvaine缓冲溶液

1 625 mL，溶解，混匀。

5.3.5草酸溶液(0. 01 mol/L) ：取草酸1. 26 g，用水溶解并稀释至1 000 mL。

5.3.6三氟yi酸溶液：取三氟yi酸0.8 ml，用水溶解并稀释至1 000 mL。

5.3.7硫酸溶液 ：取硫酸1. 85 mL，用水溶解并稀释至100 mL。

5.3.8钨酸钠溶液 ：取钨酸钠7 g，用水溶解并稀释至100 mL。

5.3.9草酸溶液(1 mol/L)：取草酸12. 6 g，用水溶解并稀释至100 ml。

5.3.10 草酸乙腈溶液：取草酸溶液(1 mol/L)20 mL，用乙腈溶解并稀释至100 mL。

5.4标准溶液制备

5.4.1标准储备液：取盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素和盐酸多西环素标准品各约10mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容至10mL容量瓶，配制成浓度为1mg/mL的土霉素、四环素，金霉素和多西环素标准储备液。-18℃以下保存，有效期1个月。

5.4.2混合标准工作液：精密量取土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准储备液各1ml，于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。2℃~8℃保存。现用现配。

5.5 材料

5.5.1 HLB 固相萃取柱：500 mg/6mL，亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯吡咯烷酮按特定比例形成的聚合物，或相当者。

5.5.2 LCX 固相萃取柱：500 mg/6mL，填料为磷酸化聚苯乙烯二乙烯苯高聚物，或相当者。

6仪器和设备

6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。

6.2分析天平：感量 0.00001g和0.01 g。

6.3组织匀浆器。

6.4涡旋混合器：3 000 r/min。

6.5低温离心机：转 速可达8 500 r/min.

6.6固相萃取装置。

6.7氮吹仪。

6.8尼龙微孔滤膜：0. 22 μm。

6.9离心管：50 ml。

7试料的制备与保存

7.1试料的制备

7.1.1组织

取适量新鲜或解冻的空白或供试组织绞碎，并使均质。

a)取均质的供试样品，作为供试试料；

b)取均质的空白样品，作为空白试料；

c)取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

7.1.2牛奶

取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，混合均匀。

a)取均质的供试样品，作为供试试料；

b)取均质的空白样品，作为空白试料；

c)取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

7.1.3鸡蛋

取适量新鲜的供试鸡蛋，去壳，并使均质。

a)取均质的供试样品，作为供试试料：

b)取均质的空白样品，作为空白试料；

c) 取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液， 作为空白添加试料。

7.2试料的保存

- 18℃以下保存，3个月内进行分析检测。

8测定步骤

8.1 提取

8.1.1 皮+脂肪

取试料5g(准确至±0.02g)，加二氯甲烷15mL，涡旋1min，振荡5min，加EDTA•2Na-Mcllvaine缓冲溶液15 mL，涡旋1 min，振荡5 min，8 500 r/min离心5 min，取上清液。下层溶液用EDTA•2Na-Mcllvaine缓冲溶液重复萃取2次，每次15mL，合并上清液，中性滤纸过滤，备用。

8.1.2 肌肉、肝脏、肾脏、牛奶、鸡蛋

称取试料5 g(准确至±0.02 g)，加EDTA•2Na- Mcllvaine缓冲溶液20 mL，涡旋1 min， 振荡10 min，加硫酸溶液5 mL、钨酸钠溶液5 mL，涡旋1 min，8 500 r/min离心5 min，取，上清液。残渣用EDTA•2Na-Mcllvaine缓冲溶液20 mL、10 mL各提取2次，合并，上清液，中性滤纸过滤，备用。

8.2 净化

HLB柱依次用甲醇、水和EDTA•2Na-Mcllvaine缓冲溶液各5 mL活化。备用液过柱，待全部备用液流出后，依次用水、5%甲醇溶液各10ml.淋洗，抽干30s，用甲醇6mL洗脱，收集洗脱液于刻度试管中，加水2 mL，混匀，过甲醇5 mL、水5 mL活化的LCX柱，待全部液体流出后，用水、甲醇各5 mL淋洗，抽干1 min，草酸乙腈溶液6mL洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹至0.5mL~1.0mL，再加甲醇0.4mL，用草酸溶液(0.01 mol/L)稀释至2. 0 mL，微孔滤膜过滤，高效液相色谱测定(上机溶液应在24 h内完成测定)。

8.3标准曲线的制备

精密量取混合标准工作液适量，用草酸溶液(0.01 mol/L) 稀释成浓度为0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0. 2 μ/mL、0， 5 μ/ml、1μ/ml、2μ/ml、5μ/ml的系列混合标准液，供高效液相色谱测定。以测得的峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

8.4 测定

8.4.1液相色谱参考条件

a)色谱柱：C(150 mmX4.6mm ，5 um)，或相当者；

b)流动相：A 为三氟yi酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；

c) 检测波长：350 nm；

d) 进样量：50 μL；

e) 柱温：30℃。

8.4.2测定法

取试料溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，按外标法计算。标准溶液及试料溶液中四环素类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。试料中四环素类药物的保留时间与标准工作液相应峰的保留时间相对偏差应在±2.5%以内。在上述色谱条件下，标准溶液的高效液相色谱图分别见附录B。

8.5空白试验

取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。

9结果计算和表述

试料中四环素类药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。

式中：

X一试料中相应的四环素类药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；

A一试料中相的四环素类的物的峰面积；

As一标准溶液中相应的四环素类药物的峰面积；

Cs 一标准溶液中相应的四环素类药物浓度的数值，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V一最终试料定容体积的数值，单位为毫升（mL）。

m一供试试料质量的数值，单位为克(g)。

10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度

10.1 灵敏度

本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉，鸡蛋，牛奶，鱼皮+肉、虾肌肉中检测限为20μg/kg，定量限为50 μug/kg；在猪、牛、羊、鸡的肝脏、肾脏，猪、鸡的皮+脂肪的检测限为50μ/kg，定量限为100 μg/kg.

10.2准确度

本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉50μg/kg ~200μg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在猪、牛、羊、鸡肝脏100 μg/kg~ 600μg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在猪、牛、羊、鸡肾脏组织100 μg/kg~1200μg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，猪、鸡皮+脂防100 μg/~600μg/kg添加浓度的回收率为60%~ 120%，鱼皮+肉、虾肌肉50μg/kg~ 200μg/kg添加浓度的回收率为60%~ 120%，在牛奶50 μg/kg~200 μg/kg添加浓度的回收率为60% ~ 120%，在鸡蛋50μg/kg~ 400μg/kg添加浓度的回收率为60%~ 120%。

10.3精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15% ，批间相对标准偏差≤15%。