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利用分析样品和填料中导入的离子交换基团之间的静电相互作用的差异的分离模式。根据离子交换官能团的电荷不同，可分为阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。阴离子交换色谱用填料中，导入了阳离子性的叔氨基或季铵基等；阳离子交换色谱用填料中，导入了阴离子性的磺酸基或羧基等。蛋白的静电性质随pH值的变化而发生变化。正负电荷正好平衡时，整体不带电荷的固有pH值称为等电点（表示为PI）。在更低pH值时，整体带正电荷；更高pH值时，整体带负电荷。
因此在阴离子交换色谱中，用pH值略高于（+0.5至+1.0）等电点的流动相；在阳离子交换色谱中，用pH值略低于（-0.5至-1.0）等电点的流动相作为分离条件优化的初始起点。
与填料静电结合的分析样品一般使用盐浓度梯度洗脱法进行洗脱。增加流动相的离子强度（盐浓度）时，静电相互作用会逐渐减弱。当与离子交换基的静电结合断开时，分析样品会在色谱柱内移动，如下图。由于分析样品不同，脱离填料时的盐浓度也就不同。因此，样品中等电点不同的组分就在不同时间被洗脱而分离开。由于蛋白的静电性质随pH值的变化而变化，因此，也可以通过改变pH值进行分离（称为pH梯度洗脱法）。
离子交换色谱具有分辨率高、吸附量大（载量高）等特点。并且，通过调整梯度洗脱的梯度，可以轻松调控或优化分离。
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