乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒操作步骤

                                                分光光度法50管/48样

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

 乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒操作步骤

试剂组成和配制：

提取液：液体×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL上清液、800 μL试剂一、50μL试剂二和50 μL试剂三，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。

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AchE活性计算公式：

1. 组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（Cpr ×V样）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

3. 血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T

=245×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；V反总：反应体系总体积（L），1 mL=0.001 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；W：样本质量，g；V样：加入上清液体积（mL），0.1 mL；T：反应时间（min），3 min。

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