七色甲状腺组织肿瘤免疫微环境解决方案

简介

成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括也基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质（ECM），所有这些总和定义为肿瘤微环境（TME），并且在肿瘤恶性进展、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用^[1]。针对肿瘤微环境的特点开发安全有效的肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中*前景的热点之一^[2]。至今， 已有多项批准药物用于不同类型肿瘤的治疗，在肿瘤治疗方面取得了令人瞩目的成就^{[2, 3]}。然而，肿瘤细胞也能够通过多种途径负向调节机体免疫应答，从而逃逸机体的免疫监管。因此，免疫治疗仍存在巨大的挑战，比如治疗效果和患者反应的不可预估性，肿瘤免疫治疗抵抗性，以及有效生物标志物缺乏等等^[4]

免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）内免疫调节的相互作用。在这些相互作用下，肿瘤微环境在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。认识免疫治疗与TME间的相互作用不仅是剖析作用机制的关键，为改善目前免疫治疗的疗效提供新的方法也具有十分重要的意义^[5]。

多重免疫组化技术在评估肿瘤微环境中各细胞组分的表达丰度，相互作用以及空间表型信息有*的优势。可在同一张切片上同时对多个靶点进行标记，帮助研究者定量评估细胞的表型和活性，全景刻画肿瘤免疫微环境以及细胞间的原位空间信息，能让我们更深入地了解肿瘤的发生机制，更有可能预测肿瘤对治疗的反应^[6-9]。本方案中， 我们使用了TissueGnostics公司TissueFAXS Cytometry全景组织流式定量分析技术结合Absin七色多重荧光免疫组化染色试剂盒(abs50015)，在扁桃体肿瘤样本中开展的多色免疫组化应用探索。 

Panel及染料信息

*Panel及染料信息（对样本中肿瘤细胞及不同免疫细胞表型进行多色标记）

在石蜡包埋的甲状腺癌组织切片上对切片进行TSA酪胺 信号方法技术，采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体 系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的Tyrosine共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，避免交叉反应，如此往复实现多重荧光标记。

使用Absin七色多重荧光免疫组化染色试剂盒的全新一代T S A 染色技术同时标记 6 种生物标志物后， 使用TissueFAXS Spectra系统进行连续全光谱高倍率成像， 构建全景（多光谱）虚拟切片。获得清晰的多色样本图像及各单通道独立信号，从多靶点角度描绘复杂的肿瘤免疫微环境。

多色免疫荧光图像获取及光谱拆分

图 1. 人甲状腺癌组织的多重IHC 染色光谱拆分。去除背景自发荧光或血细胞/胶原等自发荧光以及去除粘液团非特异性染色的各抗体独立真实染色图像。使用人甲状腺癌FFPE的七色多光谱图像及光谱拆分结果。

组织原位蛋白细胞亚群分析

TG的细胞核识别算法在组织原位提供精准的单细胞识别基础，大数据的可视化正反向回溯校验技术为其精准性提供了进一步的保障。TG组织原位流式分析功能对目标细胞进行层层筛选，可获得双标、三标乃至更 多标的细胞的定量表达及空间定位信息，可个性化分析组织切片中任意细胞的表型特征，为细胞亚群原位可视化精准分型提供强大的支撑。
图2.利用Absin七色多重荧光免疫组化技术多色标记及TissueFAXS Cytometry 技术对样本进行免疫细胞分型筛选及单靶点定量。图中展示的是通过的组织流式散点图对CD20+CD4-CD3-细胞的层层筛选识别（左图绿色圈出），散点图可追溯到图像 的每一个单细胞。首先是CD20+阳性细胞群（右上图）对此细胞群设立Cutoff线，筛选阳性细胞。并引用该阳性细胞群到下一散点图，筛选CD4与CD3阴性细胞群（右下图）。

图 3.可视化正反向回溯校验示意图。点击图像中识别到的每一个指标都可在右侧散点图中一一对应，同时散点图中的每个点都可精准追溯到图像中，便于我们观察。

空间多维度定量解析肿瘤微环境

利用TissueFAXS Cytometry技术实现从单细胞、细胞群、组织结构乃至器官级别的多模态，跨尺度的空间关系量化分析研究。比如可在研究肿瘤微环境方向通过空间数据挖掘延伸至肿瘤亚微环境，进一步细化对肿瘤亚微环境中多种标记细胞与单细胞或细胞群体之间、单细胞与肿瘤组织之间、特定细胞群体与肿瘤组织之间，肿瘤组织与血管之间等复杂的相互作用关系、进而衍生出更为丰富社会学关系，挖掘以细胞社区为功能单位的科学信息，为解释疾病的发生发展提供重要的数据来源。

图4.以肿瘤为中心细胞群体空间分布图。利用TissueFAXS Cytometry 技术中人工智能Classifier功能对组织样本肿瘤与间质区域进行特异性识别，并以肿瘤区域为中心，微米级别精度对微环境中免疫细胞的空间分布进行单细胞量化分析，不同颜色代表距离肿瘤的不同距离范围。右侧散点图中不同颜色点数表示距离肿瘤不同距离的免疫细胞浸润数量。

图5.肿瘤细胞（绿色）与NK细胞（黄色）的相互作用细胞社会关系分析示意图。通过TissueFAXS Cytometry 技术分析肿瘤细胞与NK细胞的距离关系，统计肿瘤细胞周围30范围内的NK细胞，并以连线示意。

TissueFAXS Cytometry全景组织流式定量分析平台

基于组织原位的精准单细胞定量，强大的人工智能（AI）的特征性组织识别以及像素级的精细空间量化分析等强大的运算处理功能自由交互联用，提供从染色到成像到数据挖掘的一站式解决方案，并可在肿瘤免疫学，神经生物学等不同的复杂微环境中实现精准的定制化分析。

图 6.TissueFAXS Cytometry 工作流程示意图。

References:

1.Balkwill, F.R., M. Capasso, and T. Hagemann, The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci, 2012. 125(Pt 23): p. 5591-6.
2.Bejarano, L., M.J.C. Jordao, and J.A. Joyce, Therapeutic Targeting of the Tumor Microenvironment. Cancer Discov, 2021. 11(4): p. 933-959.
3.Galon, J. and D. Bruni, Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3): p. 197-218.
4. Hegde, P.S. and D.S. Chen, Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity, 2020. 52(1): p. 17-35.
5.Tang, H., J. Qiao, and Y.X. Fu, Immunotherapy and tumor microenvironment. Cancer Lett, 2016. 370(1): p. 85-90.
6.Tsujikawa, T., et al., Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Rep, 2017. 19(1): p. 203-217.
7.Chen, S., et al., Multiomic Analysis Reveals Comprehensive Tumor Heterogeneity and Distinct Immune Subtypes in Multifocal Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Clin Cancer Res, 2022. 28(9): p. 1896-1910.
8.Chen, X., et al., CD8(+) T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene, 2021. 40(43): p. 6223-6234.
9.Wang, T., et al., Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3 ligands in tumor development. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1135-1148.

爱必信（absin）提供优质多重应该免疫组化试剂盒

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