热原（内毒素）检测

鉴于热原对人体的不良反应的效果和多样性，注射用药终产品放行都必须强制进行细菌内毒素测试（BETs），以确保患者用药安全。在制药行业，特别是注射用药，对细菌内毒素进行可靠和有效的检测是重要环节。标记为无热原或无菌的注射或植入产品必须进行内毒素检测放行。许多原材料检查也必须进行内毒素检测方能用于GMP生产，以达到设计标准的质量要求。

家兔热原检测法（RPT）

家兔的体温变化非常敏感，它们对许多病毒和致病菌非常敏感，具有能客观反映各类药品中热原在生物体内引起发热情况的特点。通过家兔的预先感染，可以进行许多抗传染药物的研究，因此可以作为热原试验的实验动物模型，常作为研究发热、解热药和检查致热原。虽然兔子是常用的试验动物，但人类被认为是对热原敏感的动物。

Seibert在1923提出用家兔检测热原，该方法于1942年被美国药典收录，简称“家兔法”（RPT），是用于药品和医疗器械热原体内检测的方法。中国药典1953年版开始收载该方法，随后的世界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的方法之一。欧洲药典也于1986年发布该方法，通过测量兔子通过静脉注射待测物质的无菌溶液引起的体温升高进行检测。家兔热原检查法可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。

单核细胞活化反应测定法(MAT)

但RPT也存在各种局限性，例如：灵敏度较低、无法区分Endotoxin和NEP；试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断；无法应用于非静脉注射药物；兔子致命的过敏性休克的可能性；动物饲养和测试设备及实验费用；属于定性反应，实验结果和热原很难进行量的换算。

鉴于这些限制，以及欧盟为减少动物用于科学目的所做的努力，欧洲药典2010在通则2.6.30新增单核细胞活化试验(MAT)热原检测方法，为RPT提供了一种体外替代方案，能够检测内毒素和非内毒素热原，在动物福利方面向前迈出的重要一步。USP<151>也收录了MAT热原检测方法。2020年版《中国药典》通则9301“注射剂安全性检查法应用指导原则”中增加单核细胞活化反应测定法(MAT)方法。用于满足技术药物发展的现状和解决传统内毒素检查法不能满足新型产品安全性控制需求这个难题。

单核细胞活化反应测定法(MAT)原理

细菌内毒素的鲎试剂检查法（LAL/TAL）

细菌内毒素检查法又称鲎试剂法，是利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应，以检测或量化药品中因革兰阴性菌产生的细菌内毒素含量是否符合规定的一种方法。此法以其快速、灵敏、经济、重现性好等特点得到了日益广泛的应用，并有取代传统的热原检查法的发展趋势。

美国动物学家FredericBang在1956年研究鲎的血液循环时，和助手JackLevin发现细菌产生的内毒素导致的凝血机理。1968年，他们初步阐明这种血液凝固是由于革兰阴性细菌内毒素激活了鲎血变形细胞溶解物的酶，使溶解物中的可溶性蛋白变成凝胶，这种凝固反应灵敏。开发出了一种的细菌检测剂——鲎试剂（LAL，LimulusAmebocyte Lysate，鲎阿米巴样细胞裂解物）。

内毒素检测方法发展史
 

根据鲎血来源不同，一般分为LAL（美洲鲎试剂）/TAL（东方鲎鲎试剂），鲎试剂检测法是一种可靠、灵敏、特异性强的内毒素检测方法，也是监管机构主要的方法，应用广泛。

基于鲎试剂发展出来的主要内毒素检测方法包括两种：凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法。供试样品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法检测结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位（EndotoxinUnit, EU）表示。

模拟鲎试验级联反应阶段，2003年以来，基于重组因子C（rFC）的细菌内毒素检测方法由于可替代动物源鲎试剂和原料可控性、抗干扰能力强等特点，被广泛用作内毒素检测的替代方法。有研究比较了LAL方法和rFC检测数据，结果显示几种方法的检测结果是可比的。重组C因子内毒素检测方法可以用于药典凝胶法和光度法的有效替代。
 

不同鲎试剂检测方法和重组C因子检测方法检测结果比较

(KQCL-Lonza动态显色法试剂盒；PyroGene-Lonza重组C因子法试剂盒；QCL-Lonza终点显色法试剂盒；Turb-Lonza动态浊度法试剂盒)

因此，目前行业内共有四种常见的细菌内毒素检测方法：凝胶法、比浊法、显色法和rFC法，并在注射剂和医疗器械生产过程控制和产品放行质控检测中有着重要的应用。比浊法、显色法和rFC法是定量方法，凝胶法为定性或者半定量方法。每种方法都有自己的特点，使用者可以根据自己的样品属性、检测需求和实验室设备情况和法规要求进行相应选择，以达到内毒素控制和热原控制的效果，患者安全。
 

内毒素检测方法

Lonza内毒素检测产品一直走在行业

Lonza（龙沙）内毒素产品于1970年代面世。半个世纪以来，为客户提供包括细菌内毒素检测试剂盒、内毒素检测软件、全自动内毒素检测仪器在内的一站式解决方案，符合FDA21 CFR part 11和欧盟EUGMP附录11法规要求，以服务于各类细胞制剂生产企业、制药企业质控部门，可植入医疗设备和透析样品质控以及科研院所等相关机构，其服务对象覆盖多数制药企业，已用于国外药物的放行，满足出口型制药企业的规模化热源测定需求。

产品包括：鲎试剂凝胶法试剂盒；基于鲎试剂，用于定量检测的动态显色法试剂盒，动态浊度法试剂盒；不依赖于鲎试剂的重组C因子检测试剂盒。LAL试剂可以实现产品的稳定供应。

此外，Lonza还提供PyroCell®MAT单核细胞活化反应测定法系统，高度敏感和可靠的用于复杂配方（如人类疫苗和基于细胞的生物制剂）的体外热原检测。
 

Lonza内毒素检测系统及组成（试剂盒、软件、仪器、自动化及周边耗材试剂）

Lonza LAL鲎试剂及重组C因子内毒素检测系统产品特点：

• 行业准

• 认可，双报优势（中欧、中美）

• 不同检测方法及产品可选（4种方法）

• 检测解决方案（试剂盒、仪器、软件、耗材）

• 可自动化（浊度法、显色法、rFC方法）

• 长时间使用经验积累和口碑基础

• 仪器软件兼容性广，适合大多数用户

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