BioLector结合 PI 染色法进行细胞裂解、细胞应激及毒性筛选的具体应用。

方法

大肠杆菌培养：采用 BioLector进行大肠杆菌 Bl21（DE3）菌种培养，培养条件：温度 37° C，振摇速度 800 rpm），微孔板为 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板（MTP），每孔填样体积为800µL。培养基为缓冲液浓度为 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。

PI 浓度：将 1mM PI 染色液溶于磷酸盐缓冲液中配制 PI 原液。此原液需无菌过滤并在 4° C 下储存。PI 嵌入 DNA 时，为避免对用户造成伤害，培养基中的最终 PI 浓度不应过高。在本应用指南中，培养基最终 PI 浓度应为 5 µM。

诱导细胞死亡：在此培养案例中，通过在 7 小时后将培温度提升至 50°C或加入纯甲醇（MeOH）来诱导细胞死亡。

测定死亡细胞：诱导细胞死亡后，PI 渗入细胞膜破裂的细胞与 DNA 结合，导致荧光偏移，然后通过PI 滤光片模块检测死亡细胞的荧光信号。

结果

细胞毒性筛选：采用 BioLector 进行PI 染色和检测进行细胞毒性筛选。添加 MeOH 对大肠杆菌 BL21（DE3）进行应激培养，如下图所示。

不同浓度的MeOH作为应急因素对大肠杆菌培养的细胞毒性筛选

培养 7 小时后，添加 27%v/v MeOH 时生长停滞，可通过散射光信号和 DO 信号检测得出：添加 MeOH 后 DO 信号立即增至初始值（100 %），表明细胞开始凋亡。添加 9%v/v MeOH 导致散射光信号减弱，表明生长斜率下降与 DO 信号相呼应。18 小时后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的细胞最终 PI 信号分别为 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。该结果对5µM PI培养基进行了空白扣除。

细胞裂解的测定：如图所示，培养 7 小时后，将温度从 37° C 提升至 50°C 以诱导细胞裂解。散射光信号表明，经 5 µM PI 处理的大肠杆菌未进一步生长，热处理 1 小时后对照组也未进一步生长。未经热处理大肠杆菌（+ 5µM PI）的生长曲线显示，细菌在 11 小时前呈指数增长，之后进入稳定期。热处理后大肠杆菌停止生长，2 小时后，细胞开始裂解，因此 PI 信号呈线性增强，并约在培养 14 小时后达到饱和。之所以延迟 2 小时，是因为热量在液体中分布并作用于细胞需要时间。未经热处理组的 PI 曲线在指数生长期可观察到背景荧光信号。

采用BioLector 通过 PI 染色测定细胞裂解

应激细胞测定：在正在进行的培养实验中，散射光和 PI 信号的结合有助于识别应激细胞。在以下案例中，大肠杆菌BL21 分别在两种不同 MOPS 缓冲液浓度的 Wilms-MOPS 培养基中培养。下图表示散射光、DO 信号、pH 值和 PI 信号随培养时间变化的实验结果。更多解析请见应用指南《利用BioLector进行细胞死亡的测定》。

采用 BioLector通过 PI 测量应激细胞

从上述应用可以看到贝克曼库尔特 BioLector高通量微生物反应器，不仅可以进行48个样品的高通量发酵，同时在线参数检测、补料和PH调控，从而实现高通量菌种筛选和工艺优化，而且结合 PI 染色法可以进行细胞裂解、细胞应激及毒性筛选的测定。