肝素亲和柱-HPLC法测定乳品中的乳铁蛋白

什么是乳铁蛋白？

乳铁蛋白可以响应各种生理和环境的变化，因此它被认为是先天防御系统的关键组成成分。乳铁蛋白对多种细菌、真菌、酵母、病毒和寄生虫表现出强大的抗菌活性。它还具有抗炎和抗癌活性，并具有多种酶功能。乳铁蛋白在维持体内细胞铁水平中起关键作用。

乳铁蛋白添加量并不是越高越好，如果婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量过高，长期饮用会导致宝宝摄入过量的铁，易引起铁中毒，另外体内乳铁蛋白含量过高时还有可能会增加肾脏负担。

国家卫生部2012-3-15颁布实施的《GB-14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》明确规定了食品中的添加剂量，每100g≤100mg。

使用对象

IAC-SEP肝素亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白，它广泛的应用乳制品样品的净化，该方法速度快、操作简单、准确性高，对提高乳制品的质量和安全性起到十分重要的作用。

原理

肝素亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白，样品前处理后，通过亲和柱净化，乳铁蛋白特异性吸附在亲和柱上，用淋洗液将亲合柱上的杂质除去，用洗脱液通过分离柱，将乳铁蛋白亲和柱上分离下来，最后，将洗脱液注入HPLC或LC-MS进行测定。

样品前处理：

1、液体奶样品：

• 牛初乳乳铁蛋白参考含量1-2mg/g,建议称量2-5g.

• 普通牛奶中乳铁蛋白参考含量小于0.5mg/g,建议称量10-20g.

称取 1-20g样品（根据需要的检测范围确定称量多少），置于50 mL离心管中。将20-30mL 结合缓冲液加入到离心管中，震荡混匀；将混匀样品转移至50mL容量瓶中，用结合缓冲液定容至50mL，摇匀。将样本4℃条件下10000 RPM离心10 min，准确吸取中间层液体10mL，作为上样液。或采用微纤维过滤，准确吸取滤液10 mL，作为上样液。

2、固体样品：（婴幼儿配方奶粉、乳粉等）

称取 4g(精确至0.01 g)试样，置于250 mL 烧杯中。将70 mL 已预热到40 ℃的结合缓冲液加入到样品中，用玻璃棒将其混合均匀，并溶解。将样品移入100 mL 容量瓶中，用少量的结合缓冲液分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用结合缓冲液定容至刻度，摇匀后分别移至两个50 mL离心管中，在4℃条件下10000RPM离心10 min，准确吸取中间层液体10mL，作为上样液。或采用微纤维过滤，准确吸取滤液10 mL，作为上样液。

3、液相色谱条件

色谱柱：Cloversil XB-C4, 5μm, 300Å, 4.6×250mm

流速：1.0 mL/min

检测器：紫外检测器，280nm

进样体积：50uL

流动相：0.1%三fu乙酸与乙腈梯度洗脱，

见下表

高效液相色谱仪检测乳铁蛋白标准谱图如下：

需要准备的设备及试剂（中检维康提供）