禽流感病毒（H5N1）抗体检测原理及操作步骤

禽流感病毒（H5N1）抗体检测试剂盒

介绍

禽流感病毒(H5N1)抗体检测试剂盒检测鸡血清中的流感病毒H5N1抗体，用于评估养鸡场鸡流感疫苗免疫状况及感染鸡的血清学辅助诊断。

本试剂盒采用间接ELISA法，在酶标板微孔上预包被流感H5N1抗原。在试验中，加入稀释后的待检血清，经过温育后，若样品中含有流感H5N1特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；加入酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。

需自备的设备及试剂

1.    微量移液器： 0.5µl～10µl、10µl～100µl、100µl～1000µl。

2.    一次性移液器吸头。

3.    量筒：500ml。

4.    96孔板酶标仪。

5.    蒸馏水或去离子水。

6.    洗瓶或洗板机。

样品制备

取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液的准备

浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，如有盐结晶，摇动使结晶的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释。稀释好的洗涤液可在4℃存放一周左右。

样品的稀释

在血清稀释板中按1：101的体积比稀释待检血清（例如：200μl样品稀释液中加2μl待检血清）。

注意：阴性和阳性对照不用稀释。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品在加入到包被板微孔前应充分混匀。

注意事项

1.    试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用前应摇匀，使用后放回2～8℃。

2.    不同品种、不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。

3.    底物和终止液对皮肤和眼可能有刺激性，使用时应该注意防护。

4.    TMB（底物B液）不要暴露于强光和避免接触氧化剂。

5.    检测板拆封后应避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥剂放于自封袋中，并尽快置于2～8℃)。

6.    所有废弃物在丢弃之前应合理处理以免污染。

7.    严格遵守操作说明可以获得最hao的结果。操作过程中移液、定时和洗涤等的全部过程必须精确。

8.    血清稀释板为一次性用品，不得重复使用；血清稀释板的最大容量为300μl/孔。

操作步骤

1.    取预包被的检测板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100μl加入到检测板孔中。同时设阴性、阳性及空白对照各1孔，取阴性及阳性对照各100μl

分别加入反应孔中，空白对照仅加入100μl样本稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出）。

2.    盖上封板膜，置37℃温育30分钟。

3.    小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗3次。每次用洗涤液注满板孔（约350μl），静置1分钟后甩掉。洗涤3次后在干净吸水纸上拍干。

4.    每孔加酶结合物100μl，盖上封板膜，置37℃温育30分钟。

5.    小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗涤3次, 方法同2。切记最后在干净吸水纸上拍干。

6.    每孔先加底物A液50µl、再加底物B液50µl，混匀、盖上封板膜37℃闭光显色10分钟。

7.    每孔加终止液50μl，使反应终止，10分钟内测定结果。

结果判定

以空白对照调零用酶标仪于450nm（630nm作参比波长）读取吸光度A值。试验成立的条件是阳性对照孔A450值大于或等于0.5，阴性对照孔A450值必须小于0.15。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，试验应重做，并仔细检察各组分。

样品A450值大于0.15+阴性对照孔均值，判为阳性；样品A450值小于0.15+阴性对照孔均值，判为阴性；如阴性对照孔均值小于0.05按0.05计算。

有效期

贮存方法： 2 - 8ºC下贮存。

有效期： 12个月。

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