应用文集｜鼎力相“柱”，步入「生物制药质量属性」的缤纷世界

在生物治疗药物的生产过程中，滴度测定用于测量发酵液中目标蛋白的浓度。在以下两种重要的情况下，需要进行准确的滴度测定。种情况是在克隆筛选过程中，仅选择那些提供足量目标蛋白的转染克隆细胞株。第二种情况是在发酵工艺的放大过程中监测目标蛋白质的浓度：细胞培养基条件的优化和佳收获时间的确定依靠准确的滴度测定。

反相色谱仍然是色谱工作者“武器库”中有价值的工具之一。这是一种广为人知的技术，依赖于分析物和固定相之间的疏水相互作用。对于完整蛋白，该技术使用有机溶剂作为流动相进行梯度洗脱。在这些条件下，分子很可能发生变性。这是一种灵敏的分析技术，因为样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白质的精确质量。

肽谱分析是一种强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构体的准确位点。由于生物治疗蛋白的一级结构或氨基酸序列是已知的，因此能够预测在使用酶（例如胰蛋白酶）酶解蛋白质时将生成的片段。胰蛋白酶通过水解赖氨酸或精氨酸，以及除脯氨酸以外的任何其他氨基酸之间的键，将蛋白质分解成片段。使用这种方法，曲妥珠单抗将被分解成 62 种单独的片段，并且高分离度反相分离能够将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰，与分析软件预测的预期片段相关联。

确定蛋白质的氨基酸组成是一种成熟的技术，该技术通常与其他技术一起使用以确认正确的结构。在分析之前，通常利用酸水解使蛋白质水解成氨基酸。氨基酸也是用于制备生物治疗蛋白的细胞培养基中的关键成分。通常需要监测发酵反应期间各种氨基酸的消耗量，因此可以使用相同的色谱方法。

糖基化是一种重要的翻译后修饰，因为多聚糖在蛋白质识别和生物治疗药物疗效方面起着关键作用。生物治疗蛋白的生产需要采用哺乳动物细胞系。糖基化途径非常复杂，而且并非所有克隆都能产生所需的糖谱。监管机构认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹图谱提供了指导，包括使用特定的酶 PNGase F 切割 N-糖，用荧光试剂标记它们以提高检测灵敏度，然后使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 柱（通常与荧光检测器结合使用，但也可使用质谱）将它们分离。

蛋白质经常容易由于环境条件刺激而发生聚集，形成二聚体和大分子量低聚物或高阶结构。这在生物治疗蛋白的生产中尤其成问题，因为目标蛋白要经受可能诱导聚集的多种条件。这些条件包括发酵过程中温度和浓度的变化，以及下游处理过程中 pH 和浓度的变化。甚至剪切力（来自叶轮叶片、搅拌器和其他工程设备）也可能导致与应力相关的聚集。聚集体，特别是分子量非常大的多聚体以至亚可见颗粒的存在，可能会对健康有害。因此，先决条件是量化和确定聚集水平，并予以限制。

由于存在带正电荷和带负电荷的氨基酸以及带负电荷的多聚糖（唾液酸），意味着大分子蛋白质作为多电荷物质存在，并且有几种副反应可导致净电荷变化。抗体抗原结合区内的异构体对功能的影响可能更为重大。