北京大学肿瘤医院梁军教授团队通过 CRISPR 筛选，得到了一种驱动 HCC 细胞对治疗药物产生耐药机制的方法。并通过这种方法发现 PSTK（磷酸丝氨酰-tRNA激酶）是一种重要的 RNA 依赖性激酶，也是 HCC 细胞对靶向治疗产生抗性的关键介导因子，可通过抑制铁死亡诱导起作用。

铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。其的本质是谷胱甘肽的耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）活性下降、脂质氧化物不能通过 GPX4 催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢，之后二价的铁离子氧化脂质产生活性氧，从而促使铁死亡的发生。

因癌细胞比正常细胞利用更高水平的铁以促进其更具侵袭性的生长，且对铁诱导剂更敏感，因此，铁诱导物有望治疗肿瘤耐药，特别是在 HCC 中。

 CRISPR 筛选结果

      PSTK 抑制铁死亡诱导   

谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 是铁中毒的中心调节因子，可减轻铁中毒过程的毒性。PSTK 是参与硒代半胱氨酸生物合成的关键激酶，而硒代半胱氨酸是 GPX 蛋白的活性中心 ，因此 PSTK 的调控可以使 HCC 对靶向治疗诱导的铁离子中毒产生抗性。

肝癌患者 PSTK 过度表达与 Gpx4 表达相关

例如，在使用 Abemaciclib、Sorafenib 或 Erastin 进行靶向治疗时，会导致 HCC 细胞中产生明显的铁离子信号 (图AC)，且 PSTK-KO HCC 细胞会显示较低的 GPXs 和 GPX4 基线活性 (图D)、PSTK-KO Hep3B 细胞会表现出较高的 ROS 基线水平，并且这些水平在靶向治疗后会进一步放大 (图E)，但是 PSTK 可通过维持 GPX4 的活性来抑制铁离子的诱导。

PSTK 维持 GPX4 的活性以防止铁离子诱导

同时，作者通过 RNA-seq 分析，以及对差异表达基因进行 KEGG 富集分析 (图A) 发现，敲除 PSTK 后，磷酸化铁蛋白相关基因表达有明显差异 (图B) ，嗜铁基因组呈负富集 (图C)，与铁卟啉相关的关键保护因子下调 (图D) 。

综合代谢组学和 RNA-seq 分析将 PSTK 鉴定为铁死亡抗性的介质

细胞内氧化磷脂水平显著增加， GSH（谷胱甘肽）转化为 GSSG（氧化型谷胱甘肽） 。

代谢物水平变化

GSH 合成过程中的关键成分，γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸甘氨酸和半胱氨酸水平显著降低，胱氨酸和谷氨酸水平不会明显变化。此外，与叶酸生物合成相关的关键代谢产物水平降低，包括叶酸和 5-甲基四氢叶酸。

GSH 合成成分水平变化

 由此可见，GSH 的耗竭和一些直接、间接的靶向机制，都可以导致 GPX4 失活，而且除抑制体系 System Xc-外，直接抑制 GSH 的合成也可诱导铁细胞凋亡。因此可通过调控 PSTK 维持 GPX4 的活性和 GSH 的合成来保护 HCC 细胞免受铁细胞死亡的诱导。

      PSTK 抑制剂   

作者利用 TargetMol 的化合物库进行了基于结构的虚拟筛选以识别 PSTK 抑制剂。top 10 的化合物对接得分如图所示。通过结合模式分析，选取了 4 个具有代表性的化合物，其中两种可水解的单宁 (Punicalin 和 Geraniin) 对 PSTK 活性袋的结合亲和力最高。

虚拟筛选后top 10 的化合物
 

这两种单宁直接用于治疗 HCC 细胞时，会使得 HCC 细胞对索拉非尼更加敏感，且肿瘤细胞中 GPX4 蛋白水平会显著降低。

CCK-8 试验表明，Geraniin 和 Punicalin 具有显著的抗 HCC 活性

PSTK 和 GPX4 蛋白水平显著降低

同时，在一项动物研究中发现 Punicalin/ geraniin 与 Sorafenib 一起口服后，Punicalin 与 Sorafenib 协同作用能够显著抑制肿瘤生长。

动物实验中肿瘤体积随时间变化

因此，使用 Punicalin 阻断 PSTK 激酶活性可能是克服肝癌中索拉非尼耐药的一种有效手段。 综上所述，作者的研究确定了 PSTK 是肝癌细胞铁死亡抵抗的关键介质。从机制上讲，PSTK 的耗竭与硒代半胱氨酸依赖的 Gpx4 激活、谷胱甘肽代谢和叶酸合成的抑制有关，并可导致亚致死性铁死亡的诱导，从而使肝癌细胞对能够诱导铁死亡的靶向治疗更加敏感。因此，抑制 PSTK 可能是克服肝癌患者靶向治疗耐药性的一种新颖可行的方法，该蛋白的抑制剂值得进一步的临床研究。  陶术可提供多种 PSTK 抑制剂相关的化合物和化合物库以及虚拟筛选服务，助力领域相关研究。

References

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