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由于样品台的限制，SEM样品必须足够小，同时可能需要特殊的预处理来增加样品的电导率和稳定性，以便样品能够承受高真空条件和高能电子束的轰击。通常使用导电胶将样品牢固地安装在样品台或短柱上。SEM被广泛用于半导体晶片的缺陷分析，制造商制造出可以检查尺寸为300 mm的半导体晶片的任何部位的仪器。许多仪器都有着可以将该尺寸的物体倾斜45°并提供连续360°旋转的腔室。
一些生物样品不使用导电材料涂层，而是通过使用不同的OTO染色方法浸渍锇来增加材料的整体电导率。
当原始样品因方法限制或法律问题不适合或者不能用于扫描电镜检查时，可以人工合成复制品以避免使用原始样品。该技术分为两步: 一是使用硅基牙科弹性体制造出原始表面的模具，二是通过将合成树脂倒入模具以获得表面复型。
生物样品
扫描电镜的样品，通常要求样品*干燥，因为样品室处于高真空状态。坚硬、干燥的材料，如木头、骨头、羽毛、干燥的昆虫或贝壳(包括蛋壳)在检测时所需的进一步处理很少，但是活细胞和组织以及完整的软体生物需要化学固定来保存和稳定它们的结构。
固定通常首先是将样品浸泡在含有化学固定剂(例如戊二醛，有时与甲醛结合)和其他固定剂的缓冲溶液中，可能还有一步用四氧锇固定。接下来就是将固定好的组织脱水。由于空气干燥会导致生物样品塌陷和收缩，所以通常采用有机溶剂(如乙醇或丙酮)置换细胞中的水，再临界干燥流体(如液态二氧化碳)置换这些溶剂来实现固定。二氧化碳最终在超临界状态下被去除，因此在干燥过程中样品中不存在气液界面。
干燥样品一般用粘合剂(如环氧树脂或导电双面胶带)固定在样品台上，并在用显微镜检测前溅射金或金/钯合金。如果要对生物体内部的超微结构进行成像，可以对样品进行切片(用切片机)。
如果扫描电镜装备有低温显微镜的冷冻样品台，可以使用冷冻固定，并用低温扫描电子显微镜对冷冻固定的样品进行检测。冷冻固定的样品可以在真空下在特殊设备中冷冻断裂，以揭示内部结构，在保持冷冻状态的同时溅射涂层并将其转移到扫描电镜冷冻台上低温扫描电子显微镜也适用于对温度敏感的材料如冰 和脂肪的成像。
冷冻破碎、冷冻蚀刻或冷冻再破碎是一种特别适用于正面观察类脂膜及其掺杂的蛋白质的制备方法。该制备方法揭示了嵌入在磷脂双分子层的蛋白质。
材料
样品的背散射电子成像、特征X射线分析和X射线成像通常需要将样品研磨和抛光表面至超光滑表面。经过WDS或能谱分析的样品通常包覆有碳。一般来说，金属在扫描电镜成像之前不会涂覆涂层，因为它们导电而且提供了它们自己的接地路径。
断面分析是对断裂表面的研究，可以在光学显微镜上进行，或通常在扫描电镜上进行。首先是将断裂表面切割成合适的尺寸，并清除其他有机残留物最后将其安装在样品架上，以便用扫描电镜观察。
集成电路可以用聚焦离子束(FIB) 或其他离子束铣削仪器切割，以便在扫描电镜中观察。第一种情况下可以将扫描电镜与FIB结合。
金属、地质样品和集成电路都可以进行化学抛光，以便在扫描电镜中观察。
无机薄膜的高倍成像需要特殊的高分辨率涂层技术。
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