蛋白免疫印迹实验常见问题原因分析汇总如下：

一、检测无信号

主要可能由于以下原因导致：

1. 用于检测的二抗不匹配。解决办法：需要确定一抗的宿主。

2. 一抗二抗的浓度过低：需要耐心地重新实验。

3.一抗不识别被检测物种中的蛋白质：可以再检查以下一抗的特异性。

4.凝胶上上样的蛋白量太少：凝胶上样品过少也会导致信号弱，所以适当增加样本量也可以防止此现象发生。

5.传输效率相当低：出现这种情况可以尝试修改转移程序的操作，确保 PVDF 与甲醇预孵育。转移后干燥 PVDF 以确保蛋白质与疏水膜的结合。

6.一抗使用次数过多：亿康如果过度稀释对信号检测也会有一定的影响，所以尽量使用新稀释的一抗。

7.阻塞时间过长或洗涤次数过多：尽量减少阻塞时间和洗涤时间。

8. 检测试剂盒不起作用：这种情况出现的较少，实验中注意试剂盒的有效期是否正常，也可使用阳性对照并确保检测试剂盒正常工作。

9.NaN可能会抑制二抗：尽量避免在稀释缓冲液中使用NaN。

10.一抗或二抗的孵育时间太短：可适当延长孵化时间

11. SDS 上样缓冲液和样品裂解液没有充分混合或者混合不均匀： SDS 上样缓冲液需要随用随配，以保证其新鲜度，另外缓冲液与裂解液可以使用涡旋混合器进行充分混合。

二、无蛋白质的区域具有高背景

蛋白免疫印迹常见问题中出现这种现象，可能由于以下几种情况所导致。

1.可能由于封闭时间过短或封闭缓冲液使用不当。大多数一抗基本不会和白蛋白或酪蛋白发生交叉反应。如果任何没有蛋白质的区域具有高背景，则封闭步骤可能无法正常工作。

2.一抗或二抗的浓度过高所致：适当降低抗体浓度。

3.洗涤不够充分：可以增加洗涤的次数。

4.孵化温度过高：一抗的孵育温度以4°C左右为宜。

5.转印膜选用不当，或者转印膜干燥：一般情况下选用PVDF膜具有较好的转印效果，同时防止膜干燥。

6.较高分子量的高背景也有可能是由于还原试剂、SDS或样品加热方式时长不正确。

三、出现白带或信号迅速减弱

1.一抗或二抗过高：适当降低抗体浓度

2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鲜程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。

3.混合后的 ECL 溶液寿命缩短：注意选择合适的ECL 解决方案。

四、断带、特殊条带出现

凝胶电泳期间使用的电压过高或缓冲液温度过高会出现这种情况。

五、出现漫反射带

1.抗体浓度过高：适当降低抗体浓度。

2.凝胶上上样的蛋白质量太高：尽量减少上样量。

六、出现空白区域

这种情况多数是由于转移不均匀所造成。转移时需要确保膜在凝胶上均匀无气泡。

七、非特异性信号

有的时候高浓度的抗体也导致非特异性信号出现。内源性免疫球蛋白，尤其是在组织裂解物中 容易出现信号干扰。可以通过预先清除内源性免疫球蛋白来减少来自内源性免疫球蛋白的非特异性信号。

八、条带模糊或者出现污斑

这多数由于凝胶平衡时间不足或凝胶与膜接触不均匀所致。