在两步法RT-qPCR中，RT反应与PCR扩增单独进行。首先，RNA添加到反应混合物中，混合物包括逆转录酶和oligo-dTs (结合mRNA的poly-A尾巴)或随机六聚体(或两者都有)，合成cDNA。下一步，从管子中取出少量cDNA，置于一个新管中，作为PCR的模板与基因特定的引物一起混合。因为RT反应采用随机启动或由oligo-dTs进行启动，总RNA或总mRNA在RT步骤中被转录。

尽管这两种方法都能得到最终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

一步法RT-PCR 

一步法原理

原理 :   One step RT-PCR采用了一步反应法完成整个RT-PCR反应，即RNA-cDNA-qPCR反应操作在同一反应体系中进行，反应过程中不需增加额外的步骤，就可完成整个RT-PCR反应，具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点，可适用于各种动物、植物、病毒RNA的qPCR检测。

优点 : 

1.简便操作 

2.减少污染的可能性。（RT和qPCR反应之间无需开管）。

3.另外由于得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，使得一步法的灵敏度更高。

4.适用于定量PCR。

缺点 :灵敏度要比两步法低。不适合PCR初期条件的摸索，出了问题之后不能够很好的找到原因

两步法RT-PCR

两步法原理

原理 :   与一步法RT-PCR相比，两步法RT-PCR的缺点包括多个步骤延长了工作流程、增加样本处理和操作步骤以及提高污染和结果变异的可能性。但是两步法可以获取大量的cDNA，同时可检测单个RNA样本中多个基因。

优点 : 灵敏度要比一步法高。在初期摸索PCR条件时，可以很容易找到问题所在。还有更为关键的一点是，做两步法可以节约monney,特别是宝贵的反转录酶，把反转录体系分开做，一次的转录产物可以多次用来做PCR，非常适用于摸索PCR条件。

缺点：它更耗费时间，且带来污染的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率，选择这种方法时，应该考虑到启动会影响qPCR的结果。如果你在PCR初期建议用一步法。如果你的条件摸索成熟建议用两步法