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一、硅胶基质填料
硅胶是HPLC填料普遍的基质。除了具有无机物基质共有的高强度，还提供了一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合范围很广的配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱。硅胶基质填料适用广泛的溶剂，从极性到非极性。其缺点是在水溶性碱性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其它具有极性官能团,如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(MethyleneChloride)等。
2、反相色谱
反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
二、聚合物填料
聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其优点是在PH值为1～14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有较强的疏水性，而且大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。其缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其它无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在pH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH1～14，温度可达100℃。
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