今天给大家分享一下在用磷酸化抗体做Western Blot时，应该注意些什么。

1.警惕内部敌人

一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解时会释放出大量磷酸化蛋白的死对头——内源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态，否则即使 band 压出来也会很浅，结果也不可信。

2.低温能让他们紧紧地拥抱对方

加一抗后最好 4 度过夜，低温能让抗体和目的蛋白紧紧地拥抱对方。为什么？因为蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附，高温下容易脱落。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。4 度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。（土豪随意）磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分，就像联谊舞会上让来宾多相处一会产生 couple 的概率会大很多那样，过夜可以保证抗体和蛋白有充分的结合时间。二抗则室温 1 小时即可。

3.磷酸化抗体哪家强？

当然是 Cell signaling 公司。他家做的磷酸化抗体不错，尤其是 MAPKs 磷酸化抗体。最好根据厂商的 protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。

4．他们不宜“喝奶”

建议用含 5%BSA 的 TBST 稀释 phospho-p38 等抗体，效果不错，而不是用常见的含 5%nonfat milk 的 TBST。因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。

5.如何避免磷化蛋白君和总蛋白君在膜上“打架”？

研究完某一蛋白的磷酸化情况后一般也要研究一下该蛋白总的表达量。但两者的条带位置一样，怎么做？可以这样：压完磷酸化抗体后，把相同的 membrane 做 strip 后再压总蛋白抗体,然后再 strip 一次，再压内标 actin。

6.听 marker 的，没错

做磷酸化蛋白 WB 时,除了目标蛋白的 band 以外,往往会出现非特异性的 band。磷酸化抗体 不好的话,甚至会压出非特异性的 band,而没有你想要的 band,所以压片以后,一定要根据 markers 比对一下,你压出的 band 分子量是否正确。

7.洗涤也大有学问

洗涤对最后的背景影响也较大，millipore 最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体可以这样：1st and 2nd 抗体之间，DDW 5min X3 次，2nd 抗体后，DDW 5min X3 次，TBST  5min X1 次，DDW rinse 3-4 次。对比 TBST 洗涤的 membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片 30min，背景仍然是可以忽略的。