很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。其实，免疫组化结果分析的 protocol 教科书和实验手册上面都有。今天主要谈谈应该注意的一些事项和技巧，并且有独门绝招献上，都是干货哟。

对照染色 

和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。 

定位 

抗原表达必须在特定部位。如 LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及 p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

半定位 

现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 计算出数值；总数值 <1.0 者为（+），1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)。

图像分析仪 

如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实最想推荐的是一款图像分析软件：Image J。这是 NIH 开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。网上可以免费下载。其界面非常简洁。

现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像分析。如我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用 Image J 来计数细胞的个数呢？

首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。有时候 2 个细胞靠得比较紧密，会被计数为 1 个细胞。这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。步骤如下：Image→Binary→Watershed。这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了 2 个细胞。

然后，就可以正式开始分析了。步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞，那么 Size 项里面选择“0-infinity”。 Circularity 的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。

免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的结果。以上介绍了一些心得体会。希望广大的同学们都能做出自己想要的结果，早点发文章。