人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  人体端粒酶逆转录酶hTERT表达实时定量检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，既方便、快速地进行各种DNA模板的扩增，又实时检测和定量分析扩增产物，即端粒酶逆转录酶活性的*而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强，效果满意，质量保证。

技术背景

人体端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase；hTERT），又称hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心结构，即催化亚体（catalytic subunit）。hTERT的功能性表达是端粒酶获得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使细胞获得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速决定成分，其mRNA表达水平与端粒酶活性之间具有密切的相关性。hTERT是一单拷贝基因，定位于5q15.33，属于逆转录酶家族，具有进化上的保守性，序列总长约35kb，由16个外显子和15个内含子组成。端粒酶特异性T-motif和7个同源保守序列的RT-motif分别位于不同的外显子上。hTERTmRNA 还有7种不同的剪切转录本，分为缺失型与插入型两类。

产品内容

  引导液（Reagent A）            微升  

  逆转液（Reagent B）                微升

  补充液（Reagent C）         毫升

  反应液（Reagent D）         微升

  内参液（Reagent E）         微升

  染色液（Reagent F）         微升

  封隔液（Reagent G）         毫升

产品说明书            1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；  染色液（Reagent F）避免光照，有效保证6月

用户自备

RNA样品：用于逆转录扩增的模板

PCR管：用于样品操作的容器

恒温水槽或干式恒温仪：用于反应孵育

微型台式离心机：用于沉降反应物

荧光定量PCR仪：用于荧光定量PCR反应

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂和用户自备的总RNA样品置入冰槽里融化；同时将干式恒温仪分别设置到70℃和37℃。然后进行下列操作。

一、cDNA合成

1． 分别将融化的试剂盒里的试剂溶液涡旋震荡2秒

2． 放进微型台式离心机瞬时离心5秒

3． 移出xx微升  引导液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管

4． 加入8微升用户自备的RNA样品（1微克总RNA样品）

5． 用枪头混匀

6． 放进70℃干式恒温仪孵育3分钟

7． 即刻放进冰槽里

8． 加入xx微升  逆转液（Reagent B）

9． 用枪头混匀

10． 放进微型台式离心机瞬时离心5秒

11． 放进37℃干式恒温仪孵育60分钟

12． 即刻放进冰槽里

13． 加入xx微升  补充液（Reagent C）稀释，混匀

14． 置入冰槽里备用或放进－20℃冰箱里保存

二、实时定量PCR

1． 一次反应总量为25微升

2． 分别移取xx微升  反应液（Reagent D）和  内参液（Reagent E）到2个0.5毫升PCR管，并做好标记

3． 分别加入2微升已知cDNA合成物（注意：可以根据标准曲线计算得知；参见注意事项9）

4． 分别加入xx微升  染色液（Reagent F）

5． 分别加入xx微升  补充液（Reagent C）到总量25微升

6． 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒

7． 使用1000微升枪头加入xx滴  封隔液（Reagent G）（注意：参见注意事项12）

8． 即刻放进荧光定量PCR仪

9． 荧光定量PCR反应程序为：

10． 采集数据，进行溶解曲线分析

11． PCR产物置于－20℃保存备用

12． 或进行琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的特异性：hTERT片段为120bp；内参GAPDH片段为150bp

三、表达计算

表达量：定义为相对于正常对照样品的hTERT表达水平

GAPDH：内参，作为调节样品水平的参考指标

对照：用户可以使用hTERT低表达的正常细胞或组织作为比较对照，建议使用正常淋巴细胞

注意事项

1. 本产品为50次操作（包括50次cDNA合成，100次实时定量扩增）

2. 操作时，须戴手套

3. 本产品适合各种荧光定量PCR仪

4. 建议整个操作在4℃下进行

5. 必须使用带滤芯的枪头

6. 所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染

7. 使用时，避免污染母液

8. 建议选用正常淋巴细胞作为正常对照或校正对照，以此作为评价hTERT的参考指标；用户可以选用任何其它正常细胞或组织，例如肿瘤组织旁的正常组织等

9. 建议选用hTERT阳性表达的MCF7细胞作为阳性对照，以此构建标准曲线：纵坐标（Y轴）为Ct值，横坐标（X轴）为已知细胞量对数值或拷贝数或RNA量等，其*有效用量作为样品检测量的标准

10. 建议使用无模板作为阴性对照

11.   内参液（Reagent E）为看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）作为比较分析时样品测试用量校正统一的参考标准

12. 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入  封隔液（Reagent D）

13. 配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性

14. 试剂避免反复冻融

15. PCR扩增反应的最初3个循环为定量基线；3至15个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为Ct值（参考图像如下）

16. Ct值可以作为hTERT表达的计量单位，也可以根据标准曲线转换为表达分子数进行计量

17. 本公司提供系列端粒酶活性检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定无核酶污染