单个核细胞分离纯化的原理与方法！

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验的细胞，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。

一、原理

PBMC的密度与血液中的其他成分不同。红细胞和粒细胞的密度较大，为1.092左右；淋巴细胞和单核细胞的密度为1.076～1.090；血小板为1.030～1.035。因此，利用一种密度介于1.076～1.090之间、近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。

二、方法

1、聚蔗糖-泛影葡胺分层液法 

聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque，F-H）分层液为密度梯度离心法的分离液，其主要成分是聚蔗糖和泛影葡胺。聚蔗糖 （Ficoll） 分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点；常用的Ficoll溶液浓度为6%，密度为1.020。泛影葡胺 （Hypaque） 用来增加密度，适量加入密度为1.200、浓度为34%的Hypaque于Ficoll溶液中，配成密度为1.077±0.001的分层液，称为淋巴细胞分层液，用于淋巴细胞的分离。

分离细胞时，将肝素抗凝全血叠加在分层液上，使两者形成一个清晰的界面。水平离心后，形成不同层次的液体和细胞区带，从而分离出PBMC。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇Ficoll而凝集成串钱状，沉积于分层液底部；血小板因密度小而悬浮于血浆中；PBMC的密度稍低于分层液，故位于血浆层和分层液的界面中，呈白膜状。吸出单个核细胞，计数，用台盼蓝染色检查细胞活力。

本法分离单个核细胞的纯度可达95%，细胞获得率达80%以上，细胞活性达95％以上小鼠淋巴细胞的比重与人淋巴细胞比重不同，若分离小鼠淋巴细胞应选用小鼠淋巴细胞分离液，比重1.092±0.001。

2、Percoll分层液法

Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮 （polyvinyl pyrolidone, PVP） 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。

将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是Percoll悬液，其密度为1.1294g/ml。用PBS或细胞培养液稀释Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml，配制时用稀释液稀释60％即可。

取比重1.077的Percoll分离液X ml与离心管中，将等倍稀释的抗凝血1/2 X ml 小心叠加在分离液上，经水平离心（1500rpm）后，便得四个细胞层，从而分离出淋巴细胞。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富含淋巴细胞。

该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达98%，单核细胞纯度可达78%。  

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