全组织细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶双酶活性 染色试剂盒

   全组织细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶（Combined COX-SDH）双酶活性

染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

   全组织细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶（Combined COX-SDH）双酶活性染色试剂是一种旨在使用细胞色素C催化人工电子供体染料二氨基联苯胺的非酶源性自然氧化，形成棕褐色不溶性产物，以及使用合成电子受体四氮唑兰染料，通过反应呈现出蓝色沉淀现象，来分析全组织样品中细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶双酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。主要适用于动物组织的细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的定性检测。适宜于线粒体疾病和肌肉分型的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

肌肉组织细胞中含有氧化酶，包括细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶和NADH四氮唑兰还原酶（NADH-TR）等，通过组织化学染色，可以呈现低含量（阴性染色）和高含量（深度染色）线粒体状况，由此分辨肌纤维类型和识别线粒体肌病（myopathy）。细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸链的酶部分的总称。其存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是人工电子供体染料，通过与金属蛋白，例如含铁蛋白细胞色素C中的物理性结合，产生非酶源性自然氧化，同时提供电子（细胞色素C作为电子受体）于呼吸链的电子传递系统，由此呈现出颜色变化和沉积，形成棕褐色不溶性产物。在DAB自然氧化的同时，产生活性氧，例如过氧化氢，由过氧化氢酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通过细胞色素氧化酶的作用，亚铁细胞色素C被氧化成正铁细胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性产物被用于检测组织细胞中细胞色素氧化酶的活性。琥珀酸脱氢酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反应，产生延胡索酸（furmarate），通过黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）传递电子。基于琥珀酸脱氢酶的反应原理，使用人工电子受体染料硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的电子，而被还原，产生不溶性蓝色或蓝黑色甲暨色素。使用双酶染色，可以有效地筛选线粒体疾病和进行肌纤维分型。 

产品内容

   清理液（Reagent A）           XX毫升

   染色液A1（Reagent B1）          XX毫升

   染色液A2（Reagent B2）          XX管

   反应液A（Reagent C）          XX毫升

   染色液B（Reagent D）          XX毫升

   反应液B（Reagent E）          XX毫升

   固着液（Reagent F）           XX毫升

产品说明书                1份

保存方式

保存   染色液A和B（Reagent B和D）和   反应液A和B（Reagent C和E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于反应孵育

光学显微镜：用于染色后观察分析

实验步骤

染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取XX毫升   染色液A1（Reagent B1）到1管   染色液A2（Reagent B2）里，混匀，标记为   染色工作液，置于冰槽里备用，避免光照（注意：有效期1周）；继续移取XX毫升   染色工作液到新的15毫升锥形离心管，加入XX微升   反应液A（Reagent C），混匀后，标记为   反应工作液A，置于冰槽里，避免光照；同时移取XX毫升   染色液B（Reagent D）到新的15毫升锥形离心管，加入XX微升   反应液B（Reagent E），混匀后，标记为   反应工作液B，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。

1． 准备1个6孔细胞培养板

2． 放进新鲜切除的动物组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，最好刀切处理一下）

3． 将组织压平

4． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗组织样本

5． 小心抽去清理液

6． 小心加入XX毫升   反应工作液A，浸没整个组织

7． 放进37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照

8． 小心抽去   反应工作液A

9． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗组织样本

10． 小心抽去清理液

11． 重复实验步骤9至10二次

12． 小心加入XX毫升   反应工作液B，浸没整个组织

13． 放进37℃培养箱里孵育15分钟，避免光照

14． 小心抽去   反应工作液B

15． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗组织样本

16． 小心抽去清理液

17． 重复实验步骤15至16二次

18． 小心加入XX毫升   固着液（Reagent F），浸没整个组织

19． 室温下孵育15分钟

20． 小心抽去   固着液（Reagent F）

21． 小心加入XX毫升   清理液（Reagent A），清洗组织样本

22． 小心抽去清理液

23． 重复实验步骤21至22二次

24． 后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚）

25． 在光学显微镜下观察和计数：

单纯表达细胞色素氧化酶活性的组织细胞，呈现棕色

单纯表达琥珀酸脱氢酶活性的组织细胞，呈现蓝色

同时表达细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的组织细胞，呈现棕蓝色

注意事项

1． 本产品为10次操作

2． 操作时，须戴手套

3．    染色液和   反应液避免反复冻融

4．    染色工作液不宜久存，1周内使用为佳

5． 用户根据实际需求，按比例配制试剂用量

6． 整个操作，在避光状态下进行

7． 染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整

8． 全组织染色存在其染色不均匀、组织内部染色渗透困难等局限

9． 染色后的后续处理的切片样品可以长期保存，同样须避免光照

10． 细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶双酶双酶染色参考图像：

11． 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰